达氏鲟dmc1基因的克隆及在精子生成中的表达分析

向 浩，叶 欢，李创举，杨俊琳，3，厉 萍，杜 浩，危起伟

（1.华中农业大学水产学院，湖北武汉 430070；2.中国水产科学研究院长江水产研究所，农业部淡水生物多样性保护重点实验室，湖北武汉 430223；3.中国科学院水生生物研究所，湖北武汉 430072）

Dmc1最早发现于酵母中，是大肠杆菌（Escherichia coli）RecA 蛋 白 的 同 源 蛋 白［1］。RecA蛋白的另一个同源蛋白Rad51除了在减数分裂中起重要作用外，还参与有丝分裂重组DNA的修复。Dmc1蛋白和Rad51蛋白共同定位于减数分裂前期Ⅰ的偶线期，为同源染色体配对和交叉重组所必需［2］。1996年发现Dmc1蛋白是哺乳动物细胞减数分裂特异的重组蛋白，仅在哺乳动物处于减数分裂过程的生殖细胞中表达。人的Dmc1蛋白与酵母的Dmc1蛋白的同源性为54%，存在大肠杆菌RecA蛋白家族中保守的第二结构域部分，包括两个ATP结合位点和两个DNA结合区［3］，表明Dmc1蛋白在进化过程中是高度保守的，同时也反映了Dmc1蛋白结构上的稳定性对生物体功能的重要性。

减数分裂中，染色体的正常分离依赖于合线期同源染色体精确配对形成的二价体，而同源重组和联会复合体是影响同源染色体配对的主要因素［4-5］。在酵母菌 （Saccharomyces cerevisiae）中，一些减数分裂必需或特异基因如dmc1、rad51和hop1已被克隆［6-8］。研究发现，酵母dmc1基因的突变和敲除都会使减数分裂停滞在偶线期，导致同源染色体联会失败，减数分裂细胞内积聚大量的双链断裂（DSB）重组中间体［9］，表明dmc1在减数分裂的同源染色体配对和交叉重组中起着重要的作用［10］。近年来，不同倍性鲫鲤（Carassius auratus×Cyprinus carpio）［11］、日本鳗鲡 （Anguilla japonica）［12］、 蝾 螈 （Cynops orientalis）［13］、牦牛（Bos grunniens）和犏牛（Bos grunniens × Bos taurus）［14］、小 鼠 （Mus musculus）［3，6］、人（Homo sapiens）［3，6，15］等物种中克隆得到 dmc1的同源基因，而有关达氏鲟（Acipenser dabryanus）dmc1基因的研究尚未见报道。小鼠dmc1基因在减数分裂Ⅰ细线期到偶线期中特异表达，为同源染色体联会配对所必需。若dmc1突变或者被敲除，会导致减数分裂停滞在偶线期，不会出现同源染色体联会或在少数非同源染色体之间出现联会异常［16］；另外，犏牛睾丸组织dmc1基因低水平表达所表现出的减数分裂障碍与小鼠dmc1基因突变和敲除的表型一致，表明睾丸组织dmc1基因的低表达可能与犏牛的雄性不育有一定的关系，进一步说明dmc1在哺乳动物细胞减数分裂的同源重组过程中起着重要的作用［14］。蝾螈dmc1基因在前细线期高水平表达，并一直持续到精子生成阶段［13］。日本鳗鲡中发现dmc1基因仅在减数分裂Ⅰ的早期表达［12］，并一直持续到粗线期，但其表达量逐渐减少。在不同倍性鲫鲤中，dmc1基因也只在其早期卵巢或者精巢中特异表达［11］，显示dmc1基因在减数分裂过程中的功能保守性。

鲟鱼类是现存最早的脊椎动物之一，已生存超过2亿年，具有重要的进化地位。达氏鲟隶属鲟形目（Acipenseriformes），鲟科（Acipenseridae），鲟属，又名沙腊子、长江鲟，纯淡水定居性鱼类，是长江珍稀濒危鱼类，为国家一级保护动物，对其开展种质资源保护研究具有重要意义。目前有关达氏鲟的研究主要集中在生物形态学［17-18］、种群生态学［19-20］、遗传学及物种鉴定方面［21］。达氏鲟生殖发育相关分子研究进行了dead end［22］、vasa［23］基因的表达特征和功能分析。本研究利用PCR技术克隆得到达氏鲟dmc1基因的编码区序列，利用生物信息学方法分析达氏鲟dmc1基因编码区特征和系统进化关系；并采用RT-PCR分析达氏鲟dmc1基因在其不同组织和不同发育时期精巢的表达特征，以期获得达氏鲟减数分裂特异标记基因，为达氏鲟初级和次级精母细胞的鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验用鱼及样品

实验用鱼为全人工繁殖1～3龄的子二代达氏鲟，来自中国水产科学研究院长江水产研究所荆州太湖试验场。分别取试验鱼心、肝、脾、肾、鳃、肠、垂体、下丘脑、精巢和卵巢等组织，在液氮中速冻后，置于-80℃冰箱保存备用。对于不同发育时期的精巢组织，取一部分用Bouin’s试液固定12～16 h后，置于70%乙醇中4℃保存。

1.2 达氏鲟精巢不同发育时期组织学染色

不同发育时期的达氏鲟精巢组织在Bouin’s试液中固定后经酒精脱水、二甲苯透明，石蜡包埋切片，切片的厚度为4μm；用苏木精-伊红染色法染色（Carazzi苏木精、0.2%伊红水溶液），中性树胶封片。正置荧光显微镜（DM5000B，Leica）观察并拍照。

1.3 RNA提取及cDNA的制备

使用 RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen，Cat No.74134）试剂盒提取各种组织的总RNA，RNA浓度和纯度用核酸测定仪（Nanodrop 2000）测定，并用DNaseⅠ（TaKaRa）消化处理总RNA以消除基因组DNA的残留，最后1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。采用 PrimeScript®RT reagent Kit With gDNA Eraser（TaKaRa，Cat No.RR047A）试剂盒合成cDNA第一链，操作按照说明书进行。合成的cDNA于-20℃保存备用，用于后续编码区序列克隆和荧光定量PCR分析。

1.4 达氏鲟dmc1基因编码区序列的获得

根据达氏鲟性腺转录组数据库序列设计上、下游引物Dmc1-Fw和Dmc1-Rv（表1），以上述反转录获取的精巢cDNA为模板，扩增出dmc1基因的编码区序列。PCR扩增体系为25μL：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，模板cDNA 1μL，10×PCR Buffer：2.5μL，MgCl2：2.0μL，dNTP：0.5 μL，Taq酶：0.5μL，ddH2O：18.0μL。扩增条件为：94℃变性4 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃1 min 30 s，38 cycles；72℃延伸 10 min。PCR反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收纯化目的片段，然后克隆到pMD19-T载体上，16℃连接过夜。连接产物转化 Trans5α大肠杆菌（Escherichia coli），经 Ampicillin抗性筛选，挑取阳性菌落，扩大培养后进行菌液PCR鉴定，并由上海生工生物工程股份有限公司进行测序。

1.5 Dm c1序列分析及系统进化树构建

将测序所得核苷酸序列在NCBI中BLAST进行同源性比对，使用ORF Finder确定开放阅读框，并推导其相应的氨基酸序列；利用TMHMMServer 2.0对蛋白的跨膜区域进行预测；使用 Signal P 4.1 Server预测信号肽；ExPASy ProtParam对所推测的蛋白质基本物理化学参数进行分析；采用CLUSTAL X软件对核苷酸和氨基酸序列进行同源性的比对分析；利用MEGA 7.0软件中Neighbor-joining方法进行系统进化分析，并进行1 000次自展检验（Bootstrap）评估进化树分支可信度。

1.6 达氏鲟dmc1基因的组织表达特征分析

为分析dmc1基因在2龄达氏鲟雌、雄个体不同组织的表达特征，以各种组织cDNA为模板，用dmc1基因特异引物Dmc1-F1和Dmc1-R1（表1）进行RT-PCR检测，以β-actin为内参。反应体系：1μL cDNA为模板，上游、下游引物各0.5 μL，10×PCR Buffer：2.5μL，MgCl2：2.0μL，dNTP：0.5μL，Taq酶：0.5μL，ddH2O：18μL。扩增条件为：94℃预变性4 min；94℃ 变性30 s，54℃ 复性30 s，72℃延伸20 s，反应进行35个循环，最后72℃延伸10 min。扩增产物使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 达氏鲟dmc1基因在不同发育时期精巢的表达分析

为验证设计的定量PCR引物Ad Dmc1-qRT-F和Ad Dmc1-qRT-R（表1）的可行性，以达氏鲟精巢cDNA为模板，用ddH2O做连续10倍梯度稀释，5个浓度梯度，从1到1∶1×104，每个梯度设置3个重复，进行荧光定量PCR来建立标准曲线。20μL荧光定量PCR体系：模板1μL，荧光定量PCR上、下游引物各0.4μL，2×PowerUpTMSYBR®Green Master Mix 10μL，ddH2O 8.5μL。PCR反应程序：95℃预变性2 min；95℃变性15 s，57℃退火 15 s，72℃延伸 15 s，读板温度 77℃，读板时间5 s；40次循环，做熔解曲线分析温度为60～95℃。根据荧光值的变化规律，系统将自动生成标准曲线和熔解曲线。

以上述逆转录获得的达氏鲟不同发育时期的精巢cDNA为模板，采用qRT-PCR技术分析dmc1基因在不同发育时期精巢的表达情况。20 μL PCR反应体系为：2×PowerUpTMSYBR®Green Master Mix 10μL，上、下游引物各0.4μL，ddH2O 8.5μL。PCR反应程序同制作标准曲线进行的荧光定量PCR反应程序。每个样品设置3个平行，以达氏鲟β-actin为内参，用灭菌双蒸水代替模板作为阴性对照。应用2-ΔΔCT法确定dmc1基因mRNA表达量，利用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，当P＜0.05时认为差异显著，P＜0.01时认为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 dmc1基因编码区序列特征分析

获得达氏鲟Dmc1开放阅读框（open reading frame，ORF）为 1 029 bp，编码 342个氨基酸。ExPASy ProtParam分析达氏鲟Dmc1前体蛋白的理化性质，推测达氏鲟 Dmc1的分子式为C2964H4901N1029O1223S255，总共包括10 372个原子，其蛋白质分子量（protein molecular weight，Mr）为82.696 kDa，理论等电点（isoelectric point，pI）为5.04；该蛋白由22种氨基酸组成，其不稳定指数（instability index）为 46.85，属于不稳定蛋白；亲水性平均指数为0.829，属于疏水性蛋白。

利用SignalP 4.1 Server在线分析，结果显示该预测蛋白不存在信号肽序列，也未发现跨膜区，表明其不是分泌性蛋白、跨膜蛋白。结构域分析结果显示：达氏鲟Dmc1蛋白与其它物种一样都含有大肠杆菌RecA蛋白家族保守的第二结构域（63-342）、Rad51＿DMC1＿radA，B（103-337）结构域和 recomb＿DMC1（26-340）结构域。同时在这些保守区域内还含有两个嘌呤核苷酸的结合位点（motifs A和B）和两个DNA结合区（L1和 L2）（图1）。

表1 PCR相关引物序列Tab.1 Primers used for PCR

图1 达氏鲟Dm c1氨基酸序列的预测及与其他物种Dm c1氨基酸序列的比较Fig.1 Predicted Dm c1 am ino acid sequence of Acipenser dabryanus and alignment w ith other species

2.2 达氏鲟dmc1基因同源性分析

利用CLUSTAL X分析达氏鲟Dmc1和已经报道的其他物种Dmc1的氨基酸序列同源性。多重比对达氏鲟、日本鳗鲡、尼罗罗非鱼、斑马鱼、鲫鲤、青鱂、蝾螈、爪蟾、小鼠和人的Dmc1氨基酸序列（表2），发现在这些物种中，Dmc1氨基酸序列具有较高的同源性，其中任意两者的同源一致性都在85%以上，并且都含有两个可以结合核酸motif（GEFRTGKT和 LLIID），这表明 Dmc1蛋白在进化过程中可能比较保守。系统进化分析显示（图2），Ad Dmc1属于RecA家族Dmc1蛋白分支，且属于四足动物类分支，与硬骨鱼类分支分开。

表2 达氏鲟Dm c1氨基酸序列和其他物种的相似性比较Tab.2 Percentage identities in am ino acid sequence of Ad Dm c1 w ith other species

图2 Dm c1氨基酸序列系统发育树（达氏鲟Dm c1加粗显示）Fig.2 Phylogenetic relationship of fish Dm c1 proteins（bold font shows Acipenser dabryanus Dm c1）

2.3 达氏鲟dmc1基因在不同组织中的表达特征

采用RT-PCR方法分析dmc1基因在达氏鲟雌、雄个体9种组织中的表达特征。如图3所示，在达氏鲟雌雄个体9种组织中，dmc1基因仅在精巢和卵巢中表达；而在心、肝、脾、肾、鳃、肠、垂体和下丘脑中未发现dmc1的表达，表明dmc1基因为达氏鲟性腺特异表达。

2.4 达氏鲟dmc1基因real-time PCR标准曲线的建立

将达氏鲟精巢cDNA模板按10倍倍比稀释5个浓度梯度，对dmc1基因进行real-time PCR扩增，得到标准曲线、熔解曲线（图4）并进行分析。可知标准曲线中的拷贝数与CT值两者基本呈线性反比关系，基因片段回归方程为：Y=-3.176X+34.531，标准曲线相关系数R2=0.996，表明线性关系良好，扩增效率为106.486%，熔解曲线显示单一的峰，无非特异性峰，扩增产物单一，无非特异性扩增及引物二聚体形成。符合实验的要求，可用于后续目的基因片段的定量分析。

2.5 达氏鲟不同发育时期精巢中dmc1基因m RNA的表达水平

根据HE染色结果可将达氏鲟精巢发育分为6个时期：0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期。0期精巢中，未形成精小囊，可见少量原始生殖细胞（图5-a）；Ⅰ期精巢中，精原细胞增殖，可见大量A型精原细胞（图5-b）；Ⅱ期精巢中出现B型精原细胞，但主要还是以A型精原细胞为主（图5-c）；Ⅲ期精巢中，以初级精母细胞为主，存在着少量次级精母细胞（图5-d）；Ⅳ期精巢中，有大量初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞，还有少量的精子（图5-e）；Ⅴ期精巢中，主要是精子（图5-f）。

Real-time PCR结果（图6）显示，在0期和 I期的精巢中，dmc1基因没有表达，Ⅱ期精巢中其有微弱表达；在Ⅲ期和Ⅳ期中其表达量急剧增加，并在Ⅳ期达到最高水平；Ⅴ期精巢中其表达量显著性降低（P＜0.05）。

图3 达氏鲟dmc1基因的组织表达特性Fig.3 Tissue-specfic expression of Addmc1

图4 dmc1基因扩增动力学曲线与熔解曲线Fig.4 Am p lification dynam ics curve and m elting curve of dm c1

图5 达氏鲟精巢不同发育时期形态结构Fig.5 M orphological structure of testis of Acipenser dabryanus at different development stages

3 讨论

本研究成功克隆了达氏鲟dmc1基因的编码区序列，获得开放阅读框（ORF）为1 029bp，编码342个氨基酸。与其他鱼类Dmc1氨基酸序列进行同源性比较，发现达氏鲟Dmc1与青鱂同源性最高，为91.23%，同时与人类、小鼠也具有较高的相似性，分别为92.06%和90.88%。蛋白预测分析表明，达氏鲟Dmc1与其他物种一样都含有大肠杆菌RecA蛋白家族保守的第二结构域、recomb＿DMC1结构域和Rad51＿DMC1＿radA，B结构域，并且在这些保守区域内还含有两个嘌呤核苷酸的结合位点（motifs A和 B）［9］和两个 DNA结合区（L1、L2），其中motif A（GEFRTGKT）是ATP/GTP结合位点，这个motif广泛存在于Dmc1及同源蛋白、DNA重组与修复蛋白RecA和Rad51中［15］。根据Dmc1的多重序列比对和系统进化分析发现，Ad Dmc1属于RecA家族Dmc1蛋白分支，且属于四足动物类分支，与硬骨鱼类分支分开，初步认为本研究克隆得到的序列是达氏鲟dmc1基因。

图6 达氏鲟精巢不同发育时期dmc1基因mRNA的相对表达水平Fig.6 Relativem RNA level of dmc1 gene of testis in Acipenser dabryanus at different development stages

对多种鱼类研究发现，dmc1基因在不同组织的表达特征较为保守，即仅在性腺中特异表达。在红鲫、鲤、四倍体鲫鲤及三倍湘云鲫中［11］，dmc1基因只在其早期卵巢或者精巢中特异表达。在第四代雌核发育二倍体鲫鲤中（G4）［24］中，同样发现dmc1基因只在G4性腺中表达。本研究通过RTPCR分析发现，达氏鲟dmc1基因也只在性腺中特异表达，说明其可能只在性腺中发挥作用。

在达氏鲟不同发育时期精巢的研究结果表明，dmc1基因在0～Ⅰ期精巢中不表达；在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期精巢中其表达量逐渐升高，并在Ⅳ期精巢中达到最高；在Ⅴ期精巢中，其表达量显著性下降（P＜0.05）。结合HE染色结果发现，0期精巢中未形成精小囊，可见少量原始生殖细胞；Ⅰ期精巢中精原细胞增殖，可见大量A型精原细胞；Ⅱ期精巢中出现B型精原细胞，但主要还是以A型精原细胞为主；Ⅲ期精巢中，以初级精母细胞为主，存在着少量次级精母细胞；Ⅳ期精巢中，有大量初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞，还有少量的精子；Ⅴ期精巢中，主要是精子，初步推断dmc1基因主要在精母细胞中表达。这与dmc1基因在小鼠中的表达特征类似，小鼠dmc1基因仅在减数分裂I细线期到偶线期的精母细胞中特异表达［9］。然而，在蝾螈的研究中，发现dmc1基因在减数分裂I细线期开始显著表达，且一直持续至精子生成阶段，即dmc1基因不仅在精母细胞中表达，而且在精子细胞中也表达［13］，这表明dmc1基因可能在单倍体细胞（如精子细胞）中发挥一定的作用，并非仅调控减数分裂过程中染色体的联会和重组。日本鳗鲡中，dmc1基因只在减数分裂Ⅰ的早期表达［12］，并持续到粗线期，但其表达量逐渐降低。综上所述，虽然dmc1基因在表达时期存在种间特异性，但其主要在减数分裂过程中起作用。

精子发生是一个复杂的细胞增殖及分化的过程，其中减数分裂又是最为关键的步骤。在此过程中，一些基因的存在与否、表达水平对形成具有活性的成熟精子有着至关重要的作用［25］。研究表明，dmc1基因在犏牛睾丸组织中低水平表达所表现出的减数分裂障碍与小鼠dmc1基因突变、敲除的表型一致，表明dmc1基因的低水平表达与犏牛的雄性不育有一定关系［14］，这可能对治疗雄性不育提供新思路。在酵母中，dmc1基因的突变导致减数分裂中的DSBs修复大幅减少，出现联会紊乱。而在人和小鼠的雄性个体中，dmc1基因的突变使联会紊乱，造成精子生成障碍。与哺乳动物不同，青鱂缺失dmc1基因仍会产生少量畸形精子，暗示青鱂中存在 DSBs修复的补偿途径［26］。dmc1基因作为减数分裂过程中的特异表达基因，能标记生殖细胞进行减数分裂的开始，有助于阐述一些物种从有丝分裂到减数分裂的形态转变机制［13］。经过十多年的发展，鱼类生殖细胞移植技术已成功应用到多种鱼类，在种质资源保存、增殖放流和物种恢复方面具有重大的应用潜力。近年来有关达氏鲟精原细胞移植的研究已经取得阶段性成果，但高效的移植依赖于精原干细胞的体外增殖培养。前期已开展了达氏鲟精原细胞培养方面的工作，但对培养的达氏鲟精原干细胞鉴定还有所欠缺。目前，已鉴定的达氏鲟生殖细胞标记基因有dnd和vasa，但是它们除了在精原细胞表达外，在精母细胞中也有表达。因此，有必要鉴定在特异类型生殖细胞表达的基因。本研究中dmc1基因在精子生成中所表现出的结果，推断其可能为减数分裂标记基因，将为后续体外培养精原干细胞的鉴定奠定基础。