人胃癌SGC-7901细胞内新藤黄酸含量测定HPLC法的建立及应用

刘世娟 侯甲福 王春妍 李雪梅

[摘要] 目的 建立高效液相色谱法测定人胃癌SGC-7901细胞内新藤黄酸含量的方法。 方法 采用高效液相色谱法，选取人胃癌SGC-7901细胞（贴壁细胞），色谱条件：色谱柱采用COSMOSIL C18，检测波长为360 nm，流动相为乙腈-0.1%乙酸水溶液（9：1），流速1 mL/min，柱温30℃。并对线性、稳定性、精密度、加样回收率和SGC-7901细胞内样品进行考察。 结果 新藤黄酸在（0.5～16）μg/mL浓度范围内线性关系良好，回归方程Y=3256X+517（r2=0.9995，n=6），稳定性实验5 d、10 d后RSD分别为1.73%、1.42%，精密度实验0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL浓度的RSD分别为1.33%、1.75%、0.76%、1.28%，平均加样回收率为100.11%（RSD=0.57%，n=4）。每毫克蛋白含药量为1.22、1.17、1.24、1.19、1.21 μg/mg，RSD=2.24%。 结论 本实验方法简便可靠、精密度高、重复性好，适用于人胃癌SGC-7901细胞内新藤黄酸含量的测定。

[关键词] 新藤黄酸;高效液相色谱法;SGC-7901;含量

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2019）19-0048-03

[Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography（HPLC） method for the content determination of neogambogic acid in human gastric cancer SGC-7901 cells. Methods Human gastric cancer SGC-7901 cells（adherent cells） were selected by high performance liquid chromatography（HPLC）. Chromatographic conditions： COSMOSIL C18 was for chromatographic column and the detection wavelength was 360 nm. The mobile phase was acetonitrile-0.1% aqueous acetic acid（9：1）， the flow rate was 1 mL/min， and the column temperature was 30℃. Linearity， stability， precision， sample recovery rate and intracellular sample of SGC-7901 were investigated. Results The neogambogic acid had a good linear relationship within the concentration range of（0.5-16）μg/mL. The regression equation was Y=3256X+517（r2=0.9995， n=6）. The RSD of the stability experiment was 1.73% and 1.42% after 5 d and 10 d， respectively. The RSD of the precision experiments at 0.5， 1.0， 2.0， and 4.0 μg/mL were 1.33%， 1.75%， 0.76%， and 1.28%， respectively. The average sample recovery rate was 100.11%（RSD=0.57%， n=4）. The amount of protein per mg was 1.22， 1.17， 1.24， 1.19， 1.21 μg/mg， RSD=2.24%.  Conclusion This experimental method is simple， reliable， and with high precision and good repeatability. It is suitable for the content determination of neogambogic acid in human gastric cancer SGC-7901 cells.

[Key words] Neogambogic acid; High performance liquid chromatography; SGC-7901; Content

新藤黃酸是藤黄科植物藤黄（Garcinia hanburyi Hook.f.）分泌的干燥树脂中的抗肿瘤活性成分[1]，具有毒性低、抗瘤谱广的特点，对人胃癌SGC-7901细胞、肺腺癌A-549细胞、人胃癌MGC-803细胞增殖均有一定的抑制作用[2]。新藤黄酸本身理化性质较差，在新剂型方面的研究也较多，所以精确测定细胞内药物含量就变得尤为重要，而目前多采用荧光标记的方法常常会有荧光丢失等因素的影响，导致含量的测定不够准确。本实验采用高效液相色谱法直接测定肿瘤细胞内新藤黄酸的含量，能准确定量药物含量，为定量研究肿瘤细胞内药物含量的方法提供思路[3-5]。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

高效液相色谱仪（美国安捷伦公司Agilent 1260），二氧化碳培养箱（日本三洋公司MCO-18AC），倒置显微镜（日本OLYMPUS公司CKX41），调速多用振荡器（常州国华有限公司HY-4）。

1.2 药品与试剂

新藤黄酸（牡丹江医学院药学研究所提供，纯度>98%），藤黄酸（牡丹江医学院药学研究所提供，纯度>98%），RPMI-1640培养基（美国GIBCO公司，批号：1790007），无支原体新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：180503），RIPA裂解液（碧云天生物技术），人胃癌SGC-7901细胞（牡丹江医学院药学研究所提供）。

1.3 溶液的制备[6，7]

1.3.1 储备液的配制  电子分析天平称取新藤黄酸（NGA）、藤黄酸（GA）各10.0 mg，用甲醇10 mL容量瓶内定容，混匀溶解得1 mg/mL溶液，4℃储存。

1.3.2 细胞裂解液的制备  将SGC-7901于六孔板培养，保持贴壁状态下用磷酸盐缓冲液（PBS）小心冲洗3次，每孔加入200 μL的RIPA裂解液，裂解1 min后收集裂解液。

1.3.3 细胞内液的制备  空白细胞液的制备：未给药的SGC-7901细胞用RIPA裂解液裂解，得空白细胞液。样品的制备：取90 μL空白细胞液，分别加入一定浓度的样品溶液与GA内标液各10 μL，混匀后加入1 mL乙酸乙酯，旋涡萃取3 min后，3500 r/min离心8 min，取上清液0.9 mL，N2濃缩吹干，滴入100 μL甲醇溶解，1000 r/min离心15 min，取20 μL测定NGA含量。

1.4 含量测定

1.4.1 色谱条件  色谱柱：COSMOSIL C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙腈-0.1%乙酸水溶液（9：1）;流速1 mL/min;检测波长：360 nm;柱温：30℃;进样量：20 μL。

1.4.2 专属性实验  “按1.3.2”项下方法，分别制备细胞空白基质、NGA+GA+细胞空白基质、NGA+细胞空白基质、GA+细胞空白基质、NGA+GA甲醇溶液，按“1.4.1”项下条件进行专属性实验。

1.4.3 标准曲线的绘制  用甲醇稀释NGA储备液浓度依次为5、10、20、40、80、160 μg/mL;精密量取“1.3.1”项下方法的GA样品溶液并稀释至浓度40 μg/mL，按照“1.3.2”项下方法制备不同浓度样品，绘制标准曲线。

1.4.4 精密度  精密量取NGA，按照“1.3.2”项下方法配制成样品浓度至0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL，测量批内精密度（n=6），再连续进样3 d测量批间精密度（n=6）。

1.4.5 稳定性  精密量取NGA，按照“1.3.2”项下方法配制成2批样品，浓度为0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL，两批样品不复溶（n=6），分别放置5 d、10 d后，加入100 μL甲醇复溶后测定。

1.4.6 加样回收率  按照“1.3.2”项下方法制备浓度为0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL的标准溶液，分别置于5 mL容量瓶内，分别加入NGA 2.0 μg于容量瓶，用相应标准液定容。按照“1.3.3”项下方法处理，进入HPLC进行测定，记录峰面积，计算回收率。

1.4.7 人胃癌SGC-7901细胞内样品测定  培养SGC-7901细胞于六孔板，铺满单层细胞后加入20 μg/mL的NGA，2 h后终止（n=5），PBS小心冲洗3次，加入裂解液，1 min后取100 μL含药裂解液，加入内标按照“1.3.2”项下处理，测定含量。另取20 μL测定蛋白浓度，以每毫克蛋白所含药物量为计量单位，测定每毫克蛋白含药量。

2 结果

2.1 专属性结果

通过实验排除是否有内源性物质在360 nm波长处有所吸收，通过实验结果未发现在该波长处有其他吸收峰，专属性结果显示，细胞基质内源性物质对NGA与GA的测定不存在干扰，并且峰形良好，可以进行实验（图1）。

2.2 标准曲线

以质量浓度为横坐标（X，μg/mL）、峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，回归方程Y=3256X+517（r2=0.9995，n=6）。结果表明NGA在（0.5～16）μg/mL浓度范围内线性关系良好（图2）。

2.3 精密度结果

样品的定量下限、低、中、高浓度RSD分别为1.33%、1.75%、0.76%、1.28%，RSD值均<10%，表明本方法精密度良好。

2.4 稳定性结果

为保证实验可靠，采用2个时间点来检查样品稳定性，两批样品分别放置5 d、10 d后RSD分别为1.73%和1.42%，RSD值均<10%，说明本法处理样品在10 d内稳定，测定NGA细胞内含量稳定性良好。 2.5 加样回收率结加样回收率实验结果显示平均加样回收率为100.11%，RSD=0.57%（n=4），表明加样回收率良好，实验方法可行。见表1。

2.6 SGC-7901细胞内样品测定

每毫克蛋白含药量为1.22、1.17、1.24、1.19、1.21 μg/mg，RSD=2.24%，结果表明可以通过本方法测定细胞内NGA的含量。

3 讨论

藤黄其主要活性成分为GA、NGA，国内外对GA与NGA的抗肿瘤活性报道也较多，王云龙等[8]研究NGA干预肺腺癌血管生成，苏婧婧等[9]发现NGA可对人胃癌SGC-7901细胞增殖进行抑制并产生诱导凋亡作用，谈永进等[10]研究发现NGA可诱导黑色素瘤B16细胞凋亡，戴婷婷等[11]发现NGA可通过内质网应激诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡。

NGA在新剂型的方面研究也有许多报道，如mPEG修饰的NGA介孔硅纳米粒的制备与研究[12]、NGA的羟丙基-β-环糊精包合物冻干粉[13]、磁性纳米Fe3O4载NGA复合物的制备与研究[14]等，同时也有学者通过对NGA结构进行改造提高其理化性质，如胡钟[15]研究NGA衍生物的设计、合成与抗肿瘤作用，但是NGA在癌细胞内的含量测定方法与实践鲜有报道，本实验旨在通过简单易行的方法测定NGA在癌细胞中的含量。

实验中对NGA与GA分别进行紫外光谱扫描，结果显示GA在217 nm、290 nm、362 nm有最大吸收，NGA在214 nm、358 nm最大吸收，因此综合考虑选用360 nm波长进行检测，实验研究表明该波长处无干扰。流动相曾试用甲醇-0.1%乙酸水進行洗脱，但保留时间过长且目标峰与杂质峰不能达到基线分离，选用乙腈-0.1%乙酸水，保留时间适中，峰形对称，目标峰与杂质峰能达到基线分离。柱温选择时，在相同条件下对比20℃、25℃、30℃及35℃共4个温度，结果显示，30℃时比20℃、25℃时保留时间短，同时又比35℃时分离度高，因此柱温选择30℃。样品进行处理时尝试过超声裂解物理裂解法提取待测样品，发现用时较长且裂解不完全，采用RIPA裂解简单方便，裂解完全，所以采用RIPA裂解液进行处理。

本实验仅采用一种癌细胞作为实验对象，因此不排除因为细胞株的不同而引起的误差，因此还需要进一步测定细胞蛋白浓度，以精确测定细胞内的药物含量，因此本实验通过测定每毫克蛋白含量来判定SGC-7901细胞中含有NGA的量，保证了实验方法和数据的可靠性。本实验方法的建立为定量研究细胞内的药物含量提供了一定的思路，为今后NGA的药物动力学研究提供实验依据与理论基础。

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[15] 胡钟. 新藤黄酸衍生物的设计、合成及抗肿瘤活性初步研究[D]. 合肥：安徽中医药大学，2013.

（收稿日期：2019-03-15）