过表达中期因子增强SMMC 7721细胞对5-Fu耐药及可能机制研究

慎华平 徐杰伟 朱霄峰 邱建 魏云海 张国雷 黄惠莲 严强

[摘要] 目的 探讨过表达中期因子（MK）增强SMMC 7721细胞对5-氟尿嘧啶（5-Fu）耐药及其可能的机制。 方法 将SMMC 7721细胞转染pIRES2-EGFP-MK重组质粒过表达，采用实时荧光定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹法（WB）检测MK mRNA和蛋白的表达。5-Fu处理后，采用MTT法检测SMMC 7721细胞对5-Fu的耐药。采用WB法检测磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）和NF-κB及Bcl-2、survivin、caspase-3的表达。 结果 将SMMC 7721细胞转染pIRES2-EGFP-MK重组质粒过表达后，MK mRNA和蛋白的表达增加，Con-C组细胞对5-Fu的IC50显著高于Con-A组、Con-B组[（27.36±4.31）mg/L vs （4.57±0.34）mg/L，（4.96±0.46）mg/L]，差异具有统计学意义（P<0.05）。此外，与Con-A组、Con-B组比较，Con-C组细胞p-PI3K（0.66±0.04 vs 0.35±0.03，0.57±0.03）、p-Akt（0.31±0.02 vs 0.17±0.02、0.25±0.02）、NF-κB（0.63±0.05 vs 0.27±0.02，0.53±0.04）、Bcl-2（0.42±0.04 vs 0.13±0.01， 0.38±0.04）、survivin（0.58±0.04 vs 0.18±0.02，0.51±0.04）呈現高表达，caspase-3（0.41±0.04 vs 0.88±0.06，0.43±0.03）呈现低表达（P<0.05）。 结论 过表达MK可增强SMMC 7721细胞对5-Fu耐药，其机制可能与激活PI3K/AKT信号通路有关。

[关键词] 肝癌;SMMC 7721细胞;中期因子;5-氟尿嘧啶;磷脂酰肌醇3-激酶;蛋白激酶B

[中图分类号] R735.7          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）18-0041-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of overexpression of midkine（MK） on the resistance of SMMC 7721 cells to 5-fluorouracil（5-Fu） and its possible mechanism. Methods SMMC 7721 cells were transfected into pIRES2-EGFP-MK recombinant plasmid for overexpression. Real-time quantitative PCR（qPCR） and Western blot（WB） were used to detect the expression of MK mRNA and protein. After 5-Fu treatment， the resistance of SMMC 7721 cells to 5-Fu was detected by MTT assay. The expression of phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase（p-PI3K）， phosphorylated protein kinase B（p-Akt） and NF-κB， and Bcl-2， survivin and caspase-3 were detected by WB assay. Results After overexpression of SMMC 7721 cells transfected with pIRES2-EGFP-MK recombinant plasmid， the expression of MK mRNA and protein increased， and the IC50 of 5-Fu in Con-C group increased significantly than that in the Con-A group and Con-B group[（27.36±4.31） mg/L vs 4.57±0.34] mg/L，（4.96±0.46） mg/L]， and the difference was statistically significant（P<0.05）. In addition， compared with the Con-A group and Con-B group， p-PI3K（0.66±0.04 vs 0.35±0.03， 0.57±0.03）， p-Akt（0.31±0.02 vs 0.17±0.02， 0.25±0.02）， NF-κB（0.63±0.05 vs 0.27±0.02， 0.53±0.04）， Bcl-2（0.42±0.04 vs 0.13±0.01， 0.38±0.04）， survivin（0.58±0.04 vs 0.18±0.02， 0.51±0.04） showed high expression， caspase-3（0.41±0.04 vs 0.88±0.06， 0.43±0.03） showed low expression in the Con-C group（P<0.05）. Conclusion Overexpression of MK can enhance the resistance of SMMC 7721 cells to 5-Fu， and its mechanism may be related to the activation of PI3K/AKT signaling pathway.

[Key words] Liver cancer; SMMC 7721 cells; Midkine; 5-fluorouracil; Phosphatidylinositol 3-kinase; Protein kinase B

原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国目前临床上最常见的消化系恶性肿瘤，尽管手术切除肿瘤具有显著的治疗效果，但对于难以手术切除的中、晚期HCC，化疗是其治疗首选[1-3]。然而，HCC是一种对于化疗不甚敏感的恶性肿瘤，其对化疗药物耐药是影响化疗治疗效果的关键[4]。探讨HCC化疗耐药机制，有针对性地对相关关键基因进行调控，是有效改善HCC患者化疗效果的重要手段。最新研究结果证实，中期因子（midkine，MK）在肿瘤的恶性生物学特性中发挥着重要的作用[5]。动物实验结果表明，上调肝癌细胞MK表达水平可促进肝癌细胞增殖、侵袭和转移[6]。前期研究结果也证实，沉默MK基因可增强肝癌Bel/Fu细胞对化疗药物敏感性[7]。但MK基因是否与耐药有关及其可能机制报道尚少。众多研究证实，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinaseB，Akt）信号通路及其相关因子NF-κB、B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、凋亡抑制基因survivin、细胞凋亡终末剪切酶caspase-3在HCC发生发展中具有极其重要的作用[8-10]。但其与MK关系却鲜见报道。本研究采用细胞转染技术构建过表达MK肝癌SMMC 7721细胞系，观察其对5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-Fu）耐药情况，同时检测上述蛋白的表达水平。

1 材料与方法

1.1 细胞株

SMMC 7721细胞株购自中科院上海细胞库。

1.2 试剂与仪器

pIRES2-EGFP-MK重组质粒（南京钟鼎生物科技有限公司）;5-Fu（武汉易泰科技有限公司上海分公司）;RPMI 1640培养液（美国Sigma公司）;胎牛血清（美国Sigma公司）;实时荧光定量PCR试剂盒（TIANGEN Biotech CO，LTD.）;蛋白质印迹法检测试剂（美国Thermo公司）;兔抗人p-PI3K、p-Akt、Bcl-2多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）;兔抗人survivin、caspase 3、NF-κB、MK多克隆抗体（英国Abcam公司）;鼠抗人β-actin单克隆抗体（英国Abcam公司）;辣根过氧化物酶标记IgG（英国Abcam公司）;PCR引物由Sangon Biotech CO，LTD.合成。

1.3 观察指标

包括MK mRNA表达、SMMC 7721细胞对5-Fu的IC50、p-PI3K、p-Akt、NF-κB、Bcl-2、survivin、caspase-3蛋白表达。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养  SMMC 7721细胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37℃、5% CO2下培养至细胞融合度>80%时，进行转染。

1.4.2 分组与转染  根据实验设计，将SMMC 7721细胞分为空白对照组（Con-A）;空载对照组（Con-B）：单用pIRES2-EGFP空载质粒处理;转染组（Con-C）：pIRES2-EGFP-MK重组质粒，采用脂質体2000转染。转染：吸去SMMC 7721细胞培养基，PBS清洗2次，加入基础培养基700 μL;向已加入基础培养基300 μL的1.5 mL EP管中加入2.5 μg质粒，轻轻混匀;向另一EP管中加入基础培养基和5 μL脂质体，使总体积同前一EP管，轻轻混匀;静置5 min后，将两管液体混合，静置20 min，随后转移到细胞培养皿中，放置于细胞培养箱中培养360 min后，更换含有血清、抗生素的培养基，继续放置于细胞培养箱中培养48 h，进行后续实验。

1.4.3 qPCR检测MK mRNA表达  将各组处理后的细胞培养48 h后，进行收集。按照试剂盒说明，抽提细胞总RNA，经过逆转录反应获得cDNA，然后按下述条件进行PCR反应。反应条件为：95℃下反应3 min进行预变性，随后按94℃ 15 s、60℃ 15 s、72℃ 30 s条件进行30个循环。

引物设计如下：MK：5-CCCCAGCAGCCAGCAG-3，5-CGAGGAGGGTGAGGAGGAG-3，127 bp;β-actin：5-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3，5-GTCACCTTC-ACCGTTCCAGT-3，123 bp。

利用相对定量法和微软EXCLE软件进行分析，计算公式为RQ=2-△CT，利用Graphpad prism 5软件进行作图。

1.4.4 WB检测相关蛋白表达  向提取好的细胞总蛋白中加入缓冲液进行变性，时间为10 min，随后取5 μL产物上样在100 V恒压条件下进行SDS-Page电泳，冰浴120 min电转至PVDF膜，加入50 g/L浓度脱脂牛奶常温下封闭60 min，随后加入适当浓度一抗，4℃摇床孵育过夜，次日用TBST漂洗5 min×5次，加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，TBST漂洗5 min×5次，ECL发光液反应5 min后，吸去多余发光液，压片5 min，显影15 s，水洗净进行定影、显影及曝光。以β-actin作为内参照。白灰度分析使用的软件是Image J，表达公式：目的蛋白/内参。

1.4.5 MTT法检测细胞对5-Fu敏感性  按5000个/100 μL浓度，将细胞种植在96孔板上，加入0.08、0.40、2.00、10.00、50.00 μg/mL的5-Fu，并设置空白对照和未加药对照。所有细胞培养72 h 后，将浓度为5 μg/L的MTT加入孔中，使每孔最终体积为20 μL。将96孔板放置于37℃温箱中进行孵育，时间为4 h。孵育结束后，向孔中加入DMSO，体积为150 μL。震荡后，利用酶联免疫检测仪检测每孔在490 nm 波长处的吸光度（D）值。以公式细胞抑制率（%）=（未加药物孔D 值-加药物孔D 值）/（未加药物孔D 值-空白孔D值）×100%。计算细胞增殖抑制率。利用Biss 法计算IC50值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，mRNA相对表达量、IC50、相关蛋白表达量以（x±s）表示，采用独立样本t检验进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SMMC 7721细胞转染pIRES2-EGFP-MK重组质粒效果

qPCR检测MK mRNA表达结果显示，Con-C组（0.0071±0.0023）细胞MK mRNA表达水平高于Con-A组（0.0026±0.0004）和Con-B组（0.0019±0.0003）（图1），提示SMMC 7721细胞转染pIRES2-EGFP-MK重组质粒效果显著，MK mRNA表达增高，可以进行后续实验。

2.2 MK过表达SMMC 7721细胞对5-Fu的IC50

三组细胞分别处理后，Con-C组细胞对5-Fu的IC50[（27.36±4.31）mg/L]显著高于Con-A组[（4.57±0.34）mg/L]（t=11.787，P=0.000）和Con-B组[（4.96±0.46）mg/L]（t=11.556，P=0.000），差异具有统计学意义。提示过表达MK基因可显著增强SMMC 7721细胞对5-Fu的耐药。

2.3 MK过表达对SMMC 7721细胞相关蛋白的影响

向三组细胞中加入20 μg/mL 5-Fu培养24 h，利用WB检测SMMC 7721细胞相关蛋白的表达水平。结果显示，与Con-A组和Con-B组比较，Con-C组细胞p-PI3K、p-Akt、NF-κB、Bcl-2、survivin呈现高表达，caspase-3呈现低表达，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1、图2A、图2B。

3 讨论

HCC是我国常见危害严重的恶性肿瘤，其病理过程及发病机制尚未完全明确。由于HCC早期症状不明显，确诊时往往已发展为中晚期，化疗成了HCC治疗不可或缺的重要手段。然而HCC化疗药物耐药是导致化疗失败的重要原因。

MK是一种具有多种功能的分泌型生长因子，随着胚胎发育，从广泛而高表达状态，逐渐降低表达并局限在肾脏[11]。既往研究证实，MK在神经元细胞生长、分化及其受损修复等方面发挥着重要的作用[12]。近年来，随着对MK基因研究的深入，学者们发现MK基因在肿瘤恶性生物学特征中也具有重要的作用。在乳腺癌[13]、肺癌[14]、胃癌[15]、结直肠癌[16]等众多恶性肿瘤中，表现为促癌基因的特性。此外，在肿瘤化疗药物耐药方面，MK基因表现出耐药基因的特性，其可能是一种新的肿瘤化疗药物耐药相关蛋白[15-16]。前期研究结果显示，沉默MK基因可增强肝癌Bel/Fu细胞对化疗药物的敏感性[7];而过表达MK可增强肝癌细胞对不同化疗药物的耐药性[17]。而关于MK基因耐药机制的研究尚处在起步阶段。PI3K/Akt信号通路是肿瘤发生发展的关键通路。目前，已有研究显示，PI3K/Akt信号通路参与了肝癌细胞耐药[18-20]。为进一步探索MK基因、肝癌细胞耐药和PI3K/Akt信号通路及相关蛋白之间的关系，本研究通过构建过表达MK肝癌细胞系，观察对5-Fu耐药及相关蛋白的影响。

本研究结果显示，SMMC 7721细胞转染pIRES2-EGFP-MK重组质粒后，其MK mRNA表达水平高于其他两组。提示SMMC 7721细胞转染pIRES2-EGFP-MK重组质粒效果显著，MK mRNA表达增高，可以进行后续实验。隨后，本研究利用MTT法检测细胞对5-Fu敏感性，结果显示，三组细胞分别处理后，转染pIRES2-EGFP-MK重组质粒组细胞对5-Fu的IC50显著高于其他两组。提示过表达MK基因可显著增强SMMC 7721细胞对5-Fu的耐药。为了进一步探讨其耐药机制，本研究观察了MK过表达对SMMC 7721细胞相关蛋白的影响，结果显示，与其他两组比较，转染pIRES2-EGFP-MK重组质粒组细胞的p-PI3K、p-Akt、NF-κB、Bcl-2、survivin表达水平呈现高表达，caspase-3表达水平呈现低表达。PI3K/Akt信号通路是一条经典的促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的信号通路，在恶性肿瘤发生发展中发挥着重要的作用。该信号通路过度活化后，可引起多种恶性肿瘤的化疗药物耐药。NF-κB、Bcl-2、survivin及caspase-3是PI3K/Akt信号通路中相关的重要蛋白，受PI3K/Akt信号通路调控，其改变可能与MK过表达引起PI3K/Akt信号通路活化有关。

综上所述，初步推测过表达MK可增强SMMC 7721细胞对5-Fu耐药，其机制可能与激活PI3K/AKT信号通路有关。但由于上述基因之间存在复杂的Crosstalk，对于MK在肝癌化疗药物耐药中的机制研究仍任重道远。

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（收稿日期：2019-03-12）