成人慢性免疫性血小板减少症患者T细胞亚群、NK细胞和树突状细胞亚群的水平研究

曹丹 寿黎红 费菊萍 方遒 董晓辉 徐宝连 张燕

[摘要] 目的 研究成人慢性免疫性血小板減少症（Immune Thrombocytopenia，ITP）患者免疫细胞、免疫因子表达水平以及二者之间的相关性。 方法 选取2013年11月～2017年3月期间我院血液科收治的240例ITP患者，根据ITP国际工作组提出的诊断标准分为重度ITP患者（重度ITP组）和非重度ITP患者（非重度ITP组），每组各120例。另外选择同期120例健康体检人员，作为健康组。分别检测上述三组Th1细胞、Th17细胞、调节性T细胞（Regulatory cells，Tregs）、Th17/Treg、自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）、树突状细胞（Dendritic cells，DC）等细胞比例和白介素-2（Interleukin-2，IL-2）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）、γ-干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）、免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）等免疫因子表达水平，分别分析与ITP病情之间以及二者之间的相关性。 结果 免疫细胞Th17、Treg、Th17/Treg和DC比例与患者病情呈显著相关性，而Th1、NK细胞比例与患者病情无显著相关性;免疫因子IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ与患者病情呈显著相关性，而IgG与患者病情无显著相关性。免疫细胞与免疫因子在ITP中的相关性分析显示，Th1细胞比例与IL-2、IL-6、TNF-α呈显著正相关;Th17细胞比例与IL-2、IL-6、IFN-γ呈显著正相关;Treg细胞比例与IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ呈显著负相关;Th17/Treg细胞比例与IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IgG呈显著正相关;NK细胞比例与IL-6、TNF-α、IFN-γ呈显著正相关;DC比例与IL-2、IL-6、TNF-α呈显著正相关。 结论 细胞免疫失衡引起机体免疫因子水平异常，是导致ITP发生发展的促进因素。

[关键词] ITP;T细胞亚群;NK细胞;树突状细胞亚群;免疫因子

[中图分类号] R558.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）18-0033-05

[Abstract] Objective To study the expression of immune cells and immune factors in adult patients with chronic immune thrombocytopenia（ITP） and the correlation between them. Methods A total of 240 ITP patients admitted to our Department of Hematology from November 2013 to March 2017 were enrolled. According to the diagnostic criteria proposed by the ITP International Working Group， they were divided into severe ITP patients（severe ITP group） and non-severe ITP patients（non-severe ITP group）， with 120 cases in each group. In addition， 120 health inspectors were selected as the health group. The ratio of cells of Th1 cells， Th17 cells， Regulatory cells（Tregs）， Th17/Treg， natural killer cells（NK）， and dendritic cells（DC）， and interleukin-2（IL-2）， interleukin-6（IL-6）， Tumor Necrosis Factor（TNF-α）， γ-interferon（Interferon-γ， IFN-γ）， immunoglobulin G（IgG） and other immune factor expression levels in the above three groups were detected. And their correlation with ITP conditions and their correlation with each other were analyzed respectively. Results The ratio of Th17， Treg， Th17/Treg and DC in immune cells was significantly correlated with the patient's condition， while the ratio of Th1 and NK cells was not significantly correlated with the patient's condition. The immune factors IL-2， IL-6， TNF-α， IFN-γ was significantly associated with the patient's condition， and IgG was not significantly associated with the patient's condition. Correlation analysis between immune cells and immune factors in ITP showed that the ratio of Th1 cells was positively correlated with IL-2， IL-6 and TNF-α; the ratio of Th17 cells was significantly positively correlated with IL-2， IL-6 and IFN-γ; the proportion of Treg cells was significantly negatively correlated with IL-2， IL-6， TNF-α and IFN-γ; the ratio of Th17/Treg cells was significantly positively correlated with IL-2， IL-6， TNF-α， IFN-γ and IgG. NK cell ratio was significantly positively correlated with IL-6， TNF-α and IFN-γ; DC ratio was significantly positively correlated with IL-2， IL-6 and TNF-α. Conclusion The imbalance of cellular immunity causes abnormal levels of immune factors in the body， which is a contributing factor to the development of ITP.

[Key words] ITP; T cell subsets; NK cells; Dendritic cell subsets; Immune factors

成人慢性免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）是一种发病率较高的免疫性血液疾病[1]，主要表现为血小板计数减少、皮肤黏膜出血、骨髓核细胞增多等症状[2]。ITP发病机制复杂，人体内多环节、多因素共同作用导致ITP的发生发展，免疫功能失衡及相关细胞因子紊乱是其中一个环。目前，已有研究证实细胞免疫失衡可诱导和促进ITP的发生发展[3-5]。本研究选取多个免疫细胞亚型及免疫因子，分析其与ITP病情发生发展的相关性。并据此进一步分析多个免疫细胞亚型与免疫因子之间的关系，深入探讨ITP中细胞免疫失衡与免疫因子的关系，为临床诊断治疗ITP提供参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年11月～2017年3月期间我院血液科收治的240例ITP患者，根据国际ITP工作组提出的ITP诊断标准[6，7]分为非重度ITP（非重度ITP组，n=120）和重度ITP患者（重度ITP组，n=120），另外选择门诊及体检部门健康体检人员120例，作为健康组。非重度ITP组患者中男48例，女72例;年龄27～65岁，平均（47.04±6.25）岁;重度ITP组患者中男51例，女69例;年龄32～68岁，平均（48.54±7.18）岁;健康组受检人员中男57例，女63例;年龄18～73岁，平均（46.86±7.97）岁。三组一般资料比较无统计学意义，具有可比性。

本研究纳入排除标准参考许澄伟等[8]研究。纳入标准：（1）签署书面知情同意书;（2）ITP诊断符合《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识（2016年版）》[8]，重度ITP血小板小于10×109/L，就诊时合并活动性出血需要更换其他升血小板药物或加大原先服用药物剂量;（3）健康组受检人员体检结果确认健康;（4）未合并心、肝、肺、肾等脏器严重器质性损伤;（5）初诊患者。

排除标准：（1）继发性血小板减少症、假性血小板减少症等;（2）合并其他免疫性疾病;（3）合并全身感染;（4）研究入组前3个月内服用免疫制剂;（5）妊娠期或哺乳期妇女。

1.2 方法

1.2.1 外周血Th1细胞、Th17细胞  取受检者清晨抗凝静脉血200 μL置于流式细胞管，每管加入1 μg/mL PMA工作液100 μL、50 μg/mL Ionomycin工作液8 μL、0.5 mg/mL Monensin工作液8 μL，注入RPMI-1640培养基，混匀，37℃培养4～6 h。每管加入EDTA 40 μL，混匀，避光孵育15 min。加入预处理细胞液100 μL、CD3-FITC和CD8-Percp-cy5.5各6 μL，混匀，避光孵育15 min。加入BD FACS 红细胞裂解液2 mL，混匀，避光孵育8～10 min。1500转/min离心5 min，弃上清液，加入BD intrasur kit 破膜剂 50 μL。Th1检测流式细胞管加入INF-r-PE 6 μL，Th17检测流式细胞管加入IL-17-PE 6 μL，混匀，避光孵育15 min。每管加入PBS 2 mL，混匀，1500转/min离心5 min，弃上清液，加入PBS 1000 μL重悬，使用流式细胞仪检测。

1.2.2 外周血自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）    取清晨抗凝静脉血200 μL置于流式细胞管，每管加入CD3-FITC、CD16-APC、CD56-APC、CD16-FITC抗体各5 μL，同时设立同型阴性对照。25℃避光孵育30 min，1500转/min离心5 min，弃上清液，加入PBS 1 mL，混匀。1500转/min离心5 min，弃上清液，加入PBS 1000 μL重悬，使用流式细胞仪检测。

1.2.3 外周血调节性T细胞（Regulatory cells，Tregs）    取受检者清晨抗凝静脉血200 μL置于流式细胞管，每管加入CD4-FITC 20 μL和CD25-APC 2.5 μL，混匀，避光孵育15min。加入BD intrasureTM kit破膜剂1 mL，混匀，避光孵育30 min。1500转/min离心5 min，弃上清液，加入透性缓冲液1 mL，混匀。1500转/min离心5 min，弃上清液，加入Foxp3-PE 5 μL，避光孵育40 min。加入透性缓冲液2 mL，混勻，1500转/min离心5 min，弃上清液，加入PBS 1000 μL重悬，使用流式细胞仪检测。

1.2.4 外周血树突状细胞（Dendritic cells，DC）  取受检者清晨抗凝静脉血200 μL，置于流式细胞管，加入Lin1-FITC、CD123PE、HLA-DR-PerCP混合液6 μL，同时设立同型阴性对照。25℃避光孵育15 min，加BD FACS红细胞裂解液400 μL，混匀，25℃避光8～10 min。加入2 mL PBS，混匀，1500转/min离心5 min，弃上清液。加入1000 μL PBS重悬，使用流式细胞仪检测。

1.2.5 血清白介素-2（Interleukin-2，IL-2）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）、γ-干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）、免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）  取受检者清晨抗凝静脉血5 mL，采用BN-100全自动生化分析仪（雅培，美国）进行测定。

1.3 统计学处理

研究采用SPSS17.0统计分析软件。Th1、Th17、Treg、Th17/Treg、NK细胞、DC细胞表达和IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IgG水平等均为计量资料，以（x±s）表示，组间比较采用t检验，免疫细胞和免疫因子与疾病严重程度的相关性分析采用Spearman等级相关性分析;免疫细胞表达和免疫因子水平之间的相关性采用Pearson直线相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 三组T细胞亚群、NK细胞和树突状细胞亚群表达情况

Th1、Th17、Th17/Treg、DC水平在健康组、非重度ITP组、重度ITP组均依次明显升高（F=8.429、8.436、12.451、7.388，P<0.05）;Treg在健康组、非重度ITP组、重度ITP组依次明显降低（F=6.862，P<0.05）;三组NK细胞水平比较无显著差异（F=2.974，P>0.05）;相关性分析显示，Th17、Treg、Th17/Treg和DC与ITP病情呈显著正相关，Th1、NK细胞与ITP病情无显著相关性。见表1。

2.2 三组IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IgG水平比较

IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IgG水平在健康组、非重度ITP组、重度ITP组均依次明显升高（F=12.658、11.042、16.353、12.462、8.326，P<0.05）;相关性分析显示，IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ与ITP病情呈显著正相关，IgG与ITP病情无显著相关性。见表2。

2.3 免疫因子水平和免疫细胞表达在ITP中的相关性研究

Pearson相关性分析显示，Th1细胞百分比与IL-2、IL-6、TNF-α呈显著正相关（r=0.625、0.592、0.575，P<0.05），相关性依次降低;Th17细胞百分比与IL-2、IL-6、IFN-γ呈显著正相关（r=0.785、0.652、0.588，P<0.05），相关性依次降低;Treg细胞百分比与TNF-α、IL-6、IL-2、IFN-γ呈显著负相关（r=-0.653、-0.638、-0.581、-0.579，P<0.05），相关性依次降低;Th17/Treg与IL-6、TNF-α、IL-2、IFN-γ、IgG呈显著正相关（r=0.826、0.733、0.715、0.626、0.615，P<0.05），相关性依次降低;NK细胞百分比与TNF-α、IFN-γ、IL-6呈显著正相关（r=0.869、0.731、0.634，P<0.05），相关性依次降低;DC细胞百分比与IL-6、IL-2、TNF-α呈显著正相关（r=0.600、0.561、0.541，P<0.05），相关性依次降低。见表3。

3讨论

ITP是一种获得性自身免疫性疾病，其发病已被证实与免疫功能和造血祖/干细胞异常等多种因素有关[9]。曹江等[10]研究指出，ITP患者外周血中IL22水平明显升高，Th1、Th22细胞可能通过刺激机体大量合成和分泌IL-22以促进ITP发病。旷文勇等[11]研究中发现，T淋巴细胞亚群与DC亚群比例失衡可促进儿童持续性慢性ITP的发病，并与患儿ITP临床分期和预后显著相关。

T细胞是人体免疫网络中最重要的免疫细胞，参与机体各项免疫调节，被证实与ITP疾病有密切联系。T细胞分为Th1/Th2细胞、Th17细胞、Treg细胞等，其中Th细胞主要起辅助作用，能促进T细胞和B细胞分别转化为效应细胞和浆细胞。既往研究[12]表明，ITP患者中存在Th1/Th2平衡紊乱。Th17细胞是近年来新发现的效应CD4+T细胞，被证实与多种自身免疫疾病相关。Rocha等[13]研究发现，Th17细胞表达及细胞相关因子水平在ITP患者中均显著升高。Th17细胞分泌的IL-17A炎症细胞因子与受体结合，可活化MAP激酶和核因子-κB发挥生物活性，引起机体免疫调节功能紊乱[14]。Treg细胞通过分泌细胞因子IL-10、TGF-β等参与机体免疫耐受及免疫调节[15]。最新研究[16]显示，IL-17A和IL-21通过Th17细胞相关信号通路能诱导Th17细胞的生成和抑制Treg细胞再分化，CD16+单核细胞可促进Th1细胞增殖，负向调控Th17细胞和Treg细胞，Th1/Th17/Treg平衡紊乱可能是ITP疾病潜在的治疗靶点。DC在人体免疫网络中专职抗原递呈细胞，具有一定的免疫刺激作用。凌云等[17]研究报道中，提出ITP患者外周血髓系和淋系DC數目与正常对照无显著差异，但治疗后淋系DC数目明显下降，ITP患者DC细胞水平存在异常。NK细胞在ITP中的作用尚未明确，有研究[18]发现ITP患儿的NK细胞百分比低于正常儿童，但在急性ITP患儿中与正常儿童比较无显著差异[12]。因此，考虑NK细胞在ITP中属于下游调节因子。

研究中，Th1、Th17、Th17/Treg、DC水平在健康组、非重度ITP组、重度ITP组均依次明显升高，Treg水平在健康组、非重度ITP组、重度ITP组明显降低。进一步分析显示，Th17、Treg、Th17/Treg、DC细胞水平均与患者病情呈明显相关性，表明T细胞和DC细胞参与成人ITP的发生与发展，免疫细胞在ITP发生发展中具有显著的促进作用。NK细胞对ITP影响较小，可能是通过T淋巴细胞发挥作用。研究显示三组NK细胞比较无显著差异（P>0.05），一方面可能与研究纳入样本量不足有关，另一方面考虑为不同受检群体和不同类型的ITP发病机制存在差异。

研究选取多个免疫因子分析其与ITP疾病的相关性，显示IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ与ITP病情呈显著相关性，可见免疫因子与ITP疾病有密切联系。ITP的主要免疫细胞异常在于Th细胞缺陷，Th1细胞可分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ等促炎因子，增强T细胞的杀伤活性，激活巨噬细胞和毒性T细胞[19]。Olsson等[20]研究指出，IL-2可能通过促进T细胞的直接细胞毒效应导致血小板被破坏;促使B细胞转化为浆细胞，产生大量抗血小板抗体;刺激巨噬细胞的吞噬能力，使血小板被单核巨噬细胞系统清除。TNF-α在体内可促进T细胞主要组织相容性复合体Ⅰ类抗原的表达，并增强T细胞以及B细胞的免疫应答能力。IFN-γ具有显著的免疫调节作用，可促进B细胞增殖分化成浆细胞，并增强单核巨噬细胞功能。研究[21]认为，ITP患者血清IFN-γ升高可能导致血小板相关抗体分泌增多，巨噬细胞对血小板的破坏增强。IL-6由Th2细胞分泌，研究显示，ITP患者血清中IL-6水平升高，主要与其促进B细胞增殖、分化，促使机体产生血小板抗体和增强单核巨噬吞噬功能有关。IL-6与TGF-β可诱导初始CD+4T细胞分化为Th17细胞，消除Treg细胞的抑制功能，诱导ITP发病。此外，IL-6还具有促进巨核细胞发育、成熟和分化生成血小板等作用。进一步分析免疫细胞与免疫因子水平在ITP患者中联系，显示两者在ITP患者中具有显著正相关性，免疫细胞可能是通过调控免疫因子的分泌参与ITP疾病的发生与发展。因此，临床诊疗ITP时需重点关注患者免疫水平的变化，免疫调节可作为未来ITP诊疗的研究重点和可能的治疗研究方向。

综上所述，免疫细胞和免疫因子与ITP疾病有密切联系，细胞免疫失衡可引起机体免疫因子水平异常，可能是ITP发生发展的致病机制之一。然而，由于时间、研究条件等多种因素限制，本次研究结果可能存在一定偏倚。后续仍需要更多大样本量、多中心的研究加以论证，进一步探讨免疫调节在成人ITP中的作用机制。

[参考文献]

[1] 李建琴. 异常T细胞亚群参与免疫性血小板减少症的机制研究[D].苏州大学，2013.

[2] 李明艳.免疫性血小板减少症271例临床分析[D].河北医科大学，2013.

[3] 邢伟伟，李振宇，闫志凌，等. 两种糖皮质激素联合小剂量利妥昔单抗方案治疗成人原发免疫性血小板减少症的疗效比较[J]. 中华血液学杂志，2013，34（5）：409-412.

[4] 张勇，陈文明，周合冰，等. 193例成人免疫性血小板减少症临床分析[J].首都医科大学学报，2014，35（5）：560-565.

[5] 陈洋，葛健，阮敏，等. 185例原发免疫性血小板减少症患者特异性自身抗体种类及类型与地塞米松疗效的相关性[J]. 中华血液学杂志，2015，36（3）：202-205.

[6] 杨晓阳，万梦婕，陈方平.免疫性血小板减少症指南的解读[J].中国实验血液学杂志，2018，26（2）：621-625.

[7] 中华医学会血液学分会止血与血栓学组. 成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识（2016年版）[J].中华血液学杂志，2016，37（2）：89-93.

[8] 许澄伟，龚燊鑫，何春玲，等.成人慢性免疫性血小板减少性紫癜患者血小板糖皮质激素受体的研究[J].汕头大学医学院学报，2017，30（3）：165-168，193.

[9] 鲁秀秀.艾曲泊帕治疗成人慢性原发免疫性血小板减少症的临床研究[D].山东大学，2014.

[10] 曹江，李莉，陈翀，等. 免疫性血小板减少症患者白介素-22及相关CD4+T细胞亚群的表达[J]. 中国实验血液学杂志，2012，20（6）：1432-1435.

[11] 旷文勇，顾艳艳，郑敏翠，等 .糖皮质激素对慢性免疫性血小板减少症患儿树突状细胞的影响[J]. 中国当代儿科杂志，2013，15（2）：91-94.

[12] Curtis BR.Drug-induced immune thrombocytopenia：incidence，clinical features，laboratory testing，and pathogenic mechanisms[J].Immunohematology，2014，30（2）：55-65.

[13] Rocha AM，Souza C，Rocha GA，et al. The levels of IL-17A and of the cytokines involved in Th17 cell commitment are increased in patients with chronic immune thrombocytopenia[J]. Haematologica，2011，96（10）：1560-1564.

[14] 刘晓帆，黄月婷，刘葳，等. 重组人血小板生成素治疗92例成人重型原发免疫性血小板减少症的临床观察[J].中华血液学杂志，2015，36（4）：312-315.

[15] Kuwana M.Helicobacter pylori-associated immune thrombocytope-nia：clinical features and pat hogenicmechanisms[J].World J Gastroenterol，2014，20（3）：71-72.

[16] 吳晓勇，陈广雷，王云龙，等. T细胞与免疫性血小板减少症发病机制的相关性研究进展[J]. 山东医药，2017， （4）：107-110.

[17] 凌云，曹祥山，余自强，等. 慢性特发性血小板减少性紫癜患者外周血树突细胞的变化及意义[J]. 中华血液学杂志，2008，29（3）：187-191.

[18] 范秋霞，王春美，盛光耀. NK细胞在儿童免疫性血小板减少症发病和治疗中的意义[J]. 中国小儿血液与肿瘤杂志，2014，19（4）：210-212.

[19] Abdel-Hamid SM，AI-Lithy HN.B cell activating factor gene poly-morphisms in patients with risk of idiopathic thrombocytopenic purpura[J].Am J Med Sci，2011，342（1）：9-14.

[20] Olsson B，Andersson PO，Jern SM，et al. T-cell-mediated cytotoxicity toward platelets in chronic idiopathic thrombocytopenic purpura[J]. Nature Medicine，2003，9（9）：1123-1124.

[21] 刘朝霞， 罗雅琴. Th1/Th2、Th17/Treg相关细胞因子在ITP发病中的作用研究进展[J]. 山东医药，2014，54（42）：103-105.

（收稿日期：2019-02-28）