基于网络药理学的黄芪和三七主要有效成分配伍抗缺血性脑损伤作用机制研究

唐标 唐文静 邓常清

摘要：目的  采用网络药理学方法探讨黄芪和三七主要有效成分配伍抗缺血性脑损伤作用机制，为成分筛选提供参考。方法  文献检索结合前期研究确定黄芪和三七抗缺血性脑损伤主要有效成分，通过DRAR-CPI数据库预测有效成分作用靶点，多数据库联合检索脑缺血相关疾病靶点。采用Cytoscape3.2.1软件构建有效成分-靶点网络、作用靶点蛋白相互作用（PPI）网络及疾病靶点PPI网络，交叉融合并筛选核心靶点。利用DAVID数据库对核心靶点进行生物过程和信号通路富集分析。结果  筛选出的194个核心靶点主要关联脑缺血凋亡、自噬、神经营养因子的保护作用、血管新生及炎症反应等多个过程。此外，靶点参与了脑缺血中PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、神经营养因子信号通路、血管新生途径及多种炎症反应途径。结论  上述生物过程和通路介导了黄芪和三七主要有效成分抗缺血性脑损伤的潜在机制，可为成分筛选提供参考。

关键词：黄芪;三七;脑缺血;网络药理学;靶点;信号通路

中图分类号：R277.73;R285    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）07-0109-05

Abstract： Objective To discuss the mechanism of compatibility of main active components of Astragali Radix and Notoginseng Radix et Rhizoma on cerebral ischemic injury through network pharmacology. Methods Main active components of Astragali Radix and Notoginseng Radix et Rhizoma for the treatment of cerebral ischemic injury were determined through literature search combined with preliminary experimental research. Through the DRAR-CPI database， main active components were predicted and collected， and the targets were associated with cerebral ischemia. In addition， targets for cerebral ischemia-related diseases were retrieved and collected by multiple data bases. Cytoscape 3.2.1 software was used to construct the active component-target network， target protein-protein interaction network and disease-related target protein-protein interaction network， and the two protein networkswere under cross-fusion and screening. The DAVID database was used to analyze the biological processes and pathways of core targets to predict the mechanism of action. Results The screened 194 core targets showed that the targets were associated with apoptosis， autophagy， neurotrophic factor protection， angiogenesis and inflammatory response. Furthermore， the targets were involved in PI3K-Akt signaling pathway， MAPK signaling pathway， neurotrophin signaling pathway， angiogenesis pathway， inflammatory response pathway of cerebral ischemia. Conclusion These biological processes and pathways mediated the underlying mechanisms of the main active components of Astragali Radix and Notoginseng Radix et Rhizoma against cerebral ischemic injury.

Keywords： Astragali Radix; Notoginseng Radix et Rhizoma; cerebral ischemia; network pharmacology; targets; signaling pathways

臨床上，脑卒中以缺血性脑卒中最为常见。黄芪和三七是治疗心脑血管疾病的常用有效中药，黄芪具有补气升阳作用，三七具有活血散瘀、消肿定痛功效，二者常配伍使用。实验研究表明，黄芪甲苷是黄芪中具有心脑血管效应的主要药效组分，三七总皂苷是三七中具有心脑血管效应的主要药效组分，主要含人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、和三七皂苷R1，黄芪甲苷和三七总皂苷均有明显改善脑缺血损伤作用[1-2]。前期研究我们采用中药组分配伍模式，研究了黄芪甲苷与三七中的人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1和三七皂苷R1配伍的协同增效作用，发现配伍后可通过脑缺血后的多个病理生理环节，协同对抗缺血性脑损伤[3-7]。为进一步揭示黄芪和三七主要有效成分配伍协同抗脑缺血损伤作用机制，本研究采用网络药理方法，从分子作用网络探讨黄芪和三七有效成分配伍抗缺血性脑损伤作用靶点及其关联通路，为成分筛选提供参考。

1  资料与方法

1.1  主要有效成分选择

结合文献报道和课题组前期研究，选择黄芪和三七中具有抗缺血性脑损伤作用的主要有效成分黄芪甲苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1为网络药理学分析的候选有效成分，通过Pub Chem（有机小分子生物活性数据库，http：//pubchem.ncbi. nlm.nih.gov）检索有效成分，收集结构和相关信息，建立有效成分数据集。

1.2  有效成分作用靶点预测与疾病靶点收集

DRAR-CPI数据库是以CPI（chemical-protein interactome）為方法学的预测数据库，以小分子为研究对象，基本涵盖全部上市药物和全部的人类可药性蛋白，得到一系列靶药结合强度的矩阵并形成一个结合谱，用于寻找小分子和FDA所批准药物间的相似性，进而挖掘“药物-药靶”关系，数据库通过计算输入化合物与数据库蛋白的对接情况，预测能与化合物相互作用的靶蛋白。通过DRAR-CPI数据库（https：//cpi.bio-x.cn/drar/）基于反向分子对接方法预测有效成分的作用靶点，在线输入分子结构后收集和建立作用靶点数据集。将预测到的作用靶点输入DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），通过输入靶基因名称列表并限定物种为人，并将所有靶基因名称校正为其官方名称，设定阈值P<0.05进行GO生物学过程富集初步分析和KEGG代谢通路富集初步分析，分析作用靶点的潜在作用。通过TTD（http：// bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、Drugbank（https：//www. drugbank.ca/）、OMIM（http：//www.omim.org/）、CTD（http：//ctdbase.org/）联合检索脑缺血疾病相关靶点，检索词为“Brain Ischemia”或“Cerebral Infarction”或“Hypoxia- Ischemia， Brain”或“Cerebral ischemia”，其中TTD数据检索到18个靶点，Drugbank数据库检索到12个靶点，OMIM数据库检索到82个靶点，CTD数据库检索到有实验验证的靶点95个。去除重复靶点，导入Uniprot（http：// www.Uniprot.org/），通过输入靶基因名称列表并限定物种为人，剔除非人源靶点，并将所有靶基因名称校正为其官方名称，建立疾病相关靶点数据集。

1.3  网络构建与分析

采用Cytoscape3.2.1软件构建有效成分-作用靶点网络。利用Cytoscape插件Bisogenet3.0.0，根据Bisogenet中的蛋白相互作用（PPI）数据库构建作用靶点PPI网络和疾病靶点PPI网络，输入靶基因名称列表并限定物种为人，数据设置选择蛋白与蛋白的相互作用，方法选择输入所有节点和所有的邻居，输出选择基因。网络中各节点的拓扑学特征通过Cytoscape的插件CytoNCA计算参数来评价，参数分别为度中心性（DC）、中间中心性（BC）、接近中心性（CC），这3个参数是网络药理学研究中评价网络节点重要性的核心参数，值越大说明节点在网络中越接近网络中心位置。参照文献[8]筛选方法，以DC、BC和CC对网络进行评价和筛选。

1.4  靶点的生物过程和通路富集分析

基因富集分析是指将基因按照先验知识，按照基因组注释信息进行分类。采用DAVID数据库对筛选出的核心靶点进行基因的生物学过程和代谢通路的初步富集分析[9]。通过基因的富集分析预测有效成分配伍抗缺血性脑损伤的可能机制。

2  结果

2.1  靶点预测与收集

通过DRAR-CPI数据库预测4种有效成分靶点，共收集到80个靶点，其中黄芪甲苷的作用靶点66个，人参皂苷Rb1作用靶点5个，人参皂苷Rg1的作用靶点34个，三七皂苷R1的作用靶点24个。利用DAVID数据库对作用靶点进行基因的生物学过程和代谢通路的初步富集分析，结果表明，靶点参与的主要生物过程中凋亡的调控（10个，13.5%）和氧化还原反应（9个基因，12.1%）为缺血性脑损伤的核心过程。另外预测靶点主要参与的与脑缺血有关的通路为代谢通路、MAPK信号通路、神经营养因子信号通路、cAMP信号通路、mTOR信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路、AMPK信号通路及凋亡途径。富集分析结果表明，预测靶点与脑缺血密切关联，有潜在抗缺血性脑损伤作用。此外，通过多数据联合关键词检索的方式检索到脑缺血疾病相关靶点，包括TTD数据库18个、Drugbank数据库12个、OMIM数据库82个，CTD数据库检索到有实验验证的95个靶点。剔重后得到脑缺血相关靶点199个。

2.2  网络构建与分析

构建的有效成分-作用靶点网络包含84个节点、129条边，见图1。可见1个活性成分可作用于多个靶点，多个活性成分可作用于同一靶点，体现了有效成分多靶点的协同作用特点。

构建作用靶点PPI网络和疾病靶点PPI网络。80个作用靶点生成的PPI网络包含2963个节点、64 362条边。199个疾病靶点生成的PPI网络包含4348个节点、102 093条边。采用Cytoscape的融合工具对2个PPI网络进行交叉融合，筛选共有网络，得到的共有网络包含1723个节点、43 979条边。采用CytoNCA计算网络的DC、BC和CC值并进行2次筛选。第一次以DC>68（2倍中位数）作为筛选指标，得到的初筛网络包含410个节点、15 215条边。采用DC>66.5、BC>0.001 22、CC>0.543 161进行第二次筛选，得到的核心网络包含194个节点、6105条边，194个靶点即为黄芪和三七主要有效成分配伍抗缺血性脑损伤的核心靶点。

2.3  靶點生物过程和通路富集分析

初步富集分析结果表明，靶点参与的生物过程为RNA聚合酶Ⅱ启动子的调控、凋亡的调控、基因表达、细胞黏附、蛋白磷酸化调控、蛋白泛素化调控、MAPK复合物调控、NF-κB信号通路调控、ERK1和ERK2复合物调控、自噬调控、Wnt信号通路调控、Toll样受体信号通路调控、JNK复合物调控（见图2A）。其中凋亡、自噬均为脑缺血损伤的关键过程[10]，MAPK、ERK、Wnt、Toll样受体和NF-κB信号通路为脑缺血损伤中的关键通路[11]。此外，靶点主要参与了PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、神经营养因子信号通路、泛素介导的蛋白质降解通路、ErbB信号通路、HIF-1信号通路、cAMP信号通路、TGF-β信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路和凋亡途径（见图2B）。通路富集具体结果见表1。在这些通路中，PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路为脑缺血的核心通路，可调控脑缺血的多个过程，如氧化应激、自噬、凋亡、炎症反应[12];神经营养因子信号通路和ErbB信号通路主要调节神经营养因子对脑缺血的保护作用[13];TGF-β信号通路有抗氧化、阻止细胞凋亡、促进脑缺血组织修复的多种作用;Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路和NF-κB信号通路为脑缺血中重要炎症反应通路[14];HIF-1信号通路和Wnt信号通路主要调节脑缺血中血管新生[15]。综合富集分析结果，预测黄芪和三七有效成分配伍抗缺血性脑损伤的机制主要为：①黄芪和三七有效成分配伍通过调控包括凋亡和自噬在内的多种细胞死亡方式、神经营养因子的保护作用、血管新生、炎症反应发挥对缺血性脑损伤的保护作用;②PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、神经营养因子信号通路、血管新生途径，以及包括Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路和NF-κB信号通路在内的炎症反应途径介导了黄芪和三七有效成分配伍的抗缺血性脑损伤潜在机制。

3  讨论

网络药理学整合了系统生物学、计算生物学、多向量药理学、网络分析等学科技术，从整体角度揭示药物与疾病的关联，为中药作用的多靶点、多途径效应提供了可量化数据，广泛应用于单味药多成分或复方作用机制及有效成分配伍研究。

本研究采用网络药理学方法对黄芪和三七的4种有效成分进行靶点预测，共收集到80个作用靶点，靶点的初步富集分析表明靶点与脑缺血密切关联，且在有效成分和作用靶点的对应中，存在1种有效成分对应多靶点、同一靶点对应多种有效成分的现象，体现了黄芪和三七有效成分配伍的多靶点协同作用机制，在一定程度上揭示了二者配伍的科学内涵。此外，通过多数据库联合检索收集到脑缺血的199个疾病靶点，采用Bisogenet构建作用靶点PPI网络和疾病靶点PPI网络，并对2个网络进行交叉融合筛选出共有网络，进一步采用网络药理学筛选方法对共有网络进行两次筛选，筛选出核心网络，得到黄芪和三七有效成分配伍抗脑缺血的194个核心靶点。利用DAVID数据库对核心靶点进行基因的生物学过程和代谢通路的初步富集分析，通过文献检索分析结果与脑缺血的关联性，预测黄芪和三七有效成分配伍抗缺血性脑损伤的可能机制主要为：①调控脑缺血中包括凋亡和自噬在内的多种细胞死亡方式、神经营养因子的保护作用、血管新生、炎症反应;②调控脑缺血中的PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、神经营养因子信号通路、血管新生途径及多种炎症反应途径。

目前认为，缺血性脑损伤的病理机制复杂，涉及多种生物活性分子及细胞内信号转导通路，如活性氧大爆发、一氧化氮生物利用率减少、细胞内钙超载、炎症、细胞凋亡及自噬等。前期研究表明，黄芪和三七主要有效成分配伍可通过NF-κB信号通路抑制炎症和凋亡[5]，通过PI3KⅠ/Akt/mTOR通路调控脑缺血自噬过程[16]，这与预测结果相符，为本研究预测机制提供了数据参考，也表明预测结果较准确。此外，预测结果表明，炎症反应调控是预测机制的核心，而炎症反应在脑缺血的发生发展中也起到重要作用，炎症反应参与脑缺血的病理生理学过程，并在脑缺血中起“双刃剑”作用，在缺血早期加重缺血性脑损伤，又参与组织的修复和再生。研究表明，脑缺血中神经元和胶质细胞死亡的炎症机制，主要是NOD样受体信号通路中的炎症小体介导，且炎症小体通路接受NF-κB和MAPK通路的调控，实验研究表明，在脑缺血中，炎症小体各组成蛋白表达增加，炎症小体活化产物Caspase-1、白细胞介素-1β和白细胞介素-18水平升高，且NF-κB和MAPK通路介导脑缺血中炎症小体的活化，抑制NF-κB和MAPK通路及炎症小体均可减少脑缺血损伤[17-18]。脑缺血中NF-κB和MAPK通路介导的炎症小体活化可能为黄芪和三七主要有效成分配伍抗脑缺血损伤的重要机制。但黄芪和三七主要有效成分配伍对脑缺血中核心过程和通路的调节作用，还需进一步实验研究验证。

综上，基于网络药理学分析黄芪和三七有效成分配伍抗缺血性脑损伤的作用机制，预测了核心靶点及其可能的作用机制，初步揭示了黄芪和三七有效成分配伍抗缺血性脑损伤的多靶点-多途径作用特点，可为进一步深入研究其作用机制及成分筛选提供参考。

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