益肾通淋方对良性前列腺增生大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

周宇 李海松 谢知音 王彬 管思琪 王继升

摘要：目的  观察益肾通淋方对良性前列腺增生（BPH）大鼠前列腺PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响，探讨其作用机制。方法  采用去势联合丙酸睾酮注射方法建立BPH模型，对照组行假手术。将60只SD大鼠随机分为对照组、模型组、阳性药组和益肾通淋方高、低剂量组，每组12只。于去势第8日开始灌胃给药，每日1次，连续28 d。末次给药后1 h，大鼠麻醉取前列腺，计算前列腺指数，HE染色观察前列腺组织病理形态，Western blot和RT-PCR分别检测前列腺PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白和mRNA的表达。结果  与对照组比较，模型组大鼠前列腺明显增生，PI3K、Akt和mTOR磷酸化蛋白及mRNA表达均显著升高，PI3K/Akt/mTOR信号通路激活;益肾通淋方干预后，模型大鼠前列腺指数下降，腺体变少，腺腔扩张，前列腺增生明显缓解，同时PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化水平降低，mRNA表达显著下调。结论  益肾通淋方能有效改善BPH大鼠前列腺增生，其作用机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。

关键词：益肾通淋方;良性前列腺增生;PI3K/Akt/mTOR信号通路;大鼠

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）07-0056-04

Abstract： Objective To investigate the effects of Yishen Tonglin Prescription on prostate PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in benign prostatic hyperplasia （BPH） rats; To discuss its mechanism of action. Methods The BPH model was established by the method of castration combined with testosterone propionate injection. The control group received sham-operation. Totally sixty SD rats were randomly divided into control group， model group， positive medicine group， and Yishen Tonglin Prescription high- and low-dosage groups， with 12 rats in each group. Gavage was started on the 8th day after castration， once a day for 28 days. One hour after the last administration， the rats were anesthetized， and the prostate tissue was taken to calculate the prostate index. The pathological changes of prostate tissue were observed by HE staining. The expression levels of protein and mRNA in prostate PI3K/Akt/mTOR pathway were detected by Western blot and RT-PCR respectively. Results Compared with the control group， the prostatic hyperplasia was evident in the model group， the phosphorylation level and mRNA expression of PI3K， Akt and mTOR significantly increased， and the PI3K/Akt/mTOR pathway was activated. After the intervention of Yishen Tonglin Prescription， the prostate index of the model rats decreased， the glands become fewer， the glandular cavity dilated， the prostate hyperplasia was relieved， the phosphorylation levels of PI3K， Akt and mTOR decreased， and the mRNA expression was significantly down-regulated. Conclusion Yishen Tonglin Prescription can effectively improve prostatic hyperplasia in BPH rats， and its mechanism may be related to inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

Keywords： Yishen Tonglin Prescription; benign prostatic hyperplasia; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway; rats

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是男科常見病，主要是由于性激素代谢障碍导致不同程度腺体或纤维、肌肉组织增生而造成的前列腺体积增大，临床多表现为尿频尿急、排尿困难、夜尿增多等[1]。BPH发病率随着男性年龄的增长而升高。据统计，50岁以上男性BPH发病率为50%～60%[2]。目前，BPH发病机制尚未明了，其临床治疗包括外科手术和5α-还原酶抑制剂、α受体拮抗剂等药物治疗，但均存在较明显的局限性和不良反应[3]。有研究显示，中药复方对BPH大鼠细胞凋亡有明显的抑制作用，能明显改善相应症状[4-5]。益肾通淋方为李海松教授临床治疗BPH的经验方，以补肾益气、清热利湿为治则。本研究在建立BPH大鼠模型的基础上，观察其对BPH大鼠的治疗效果，并以与细胞增殖和凋亡相关的PI3K/Akt/mTOR信号通路为切入点，探讨其疗效机制，为该方的临床应用提供依据。

1  材料与方法

1.1  动物

SPF级健康雄性SD大鼠60只，体质量为180～220 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2016-0011。飼养于温度（24±2）℃、相对湿度（50±5）%环境，明暗周期12 h/12 h，自由摄食饮水。

1.2  药物

益肾通淋方（熟地黄15 g、牛膝9 g、黄芪15 g、菟丝子9 g、丹参6 g、土茯苓9 g、金钱草15 g、玉米须15 g、冬瓜子6 g、甘草6 g等），饮片均购自北京中医药大学东直门医院中药房，全方煎煮2次，第1次加10倍量水，第2次加8倍量水，2次煎液合并，浓缩，保存备用;非那雄胺片，杭州默沙东制药有限公司，5 mg/片，批号306713。

1.3  主要试剂与仪器

兔抗鼠p-PI3K、p-Akt、p-mTOR多克隆抗体（英国Abcam），兔抗鼠GAPDH单克隆抗体（美国CST），山羊抗兔二抗（武汉博士德），PVDF膜（美国Thermo），BCA试剂盒、ECL化学发光试剂盒（北京中衫金桥），SYBR MasterMix、反转录试剂盒（日本Takara）。组织切片机、实时荧光定量PCR仪（美国Thermo），光学显微镜（德国ZEISS），超微量核酸蛋白测定仪（英国BioDrop），凝胶成像分析仪（美国Bio-Rad）。

1.4  分组及造模

大鼠适应性喂养5 d，按体质量随机分为对照组、模型组、阳性药组和益肾通淋方高、低剂量组，每组12只。除对照组大鼠外，其余组均采用去势术联合丙酸睾酮注射建立BPH模型[6]。操作方法：大鼠麻醉，去毛，常规消毒，打开腹腔，经阴囊摘除双侧睾丸，于残端处结扎止血后缝合皮肤。去势术后大鼠自行恢复7 d，于第8日皮下注射丙酸睾酮（5 mg/kg），每日1次，至实验结束。对照组大鼠予假手术对照，打开腹腔后游离但不摘除双侧睾丸，结扎止血后缝合。

1.5  给药及取材

于去势后第8日开始灌胃给药，其中阳性药组予临床等效1倍剂量非那雄胺片（0.45 mg/kg），益肾通淋方高、低剂量组分别予临床等效2、1倍剂量益肾通淋方（21.6、10.8 g/kg），对照组和模型组予等体积蒸馏水。给药体积均为10 mL/kg，每日1次，连续28 d。末次给药后1 h，大鼠麻醉，取前列腺，称重，一部分置于4%多聚甲醛中固定，另一部分置于液氮中冻存。

1.6  指标检测

1.6.1  前列腺指数测定

大鼠前列腺称重后记录数值，计算前列腺指数[前列腺质量（mg）÷体质量（g）]。

1.6.2  病理形态观察

HE染色观察大鼠前列腺组织病理形态，取固定于多聚甲醛溶液中前列腺组织，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋后，5 μm厚连续切片，经苏木素-伊红染色后脱水并用中性树胶封片，光学显微镜下观察组织病变情况，并拍照分析。

1.6.3  Western blot检测前列腺PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达

取冻存的前列腺组织，称重，加入5倍量RIPA强力裂解液，冰上匀浆后离心，分离上清液，BCA法测定总蛋白含量。制备分离胶和浓缩胶，蛋白上样（30 μg），上样完成后，将玻璃板置于电泳槽中，以恒压80 V进行凝胶电泳，至溴酚蓝完全跑出分离胶后，将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，根据目的蛋白分子量裁剪条带，分别加入稀释后一抗（内参为GAPDH，均按1∶1000稀释），4 ℃孵育过夜。次日用TBST液冲洗条带4次×10 min，加入二抗室温孵育4 h（1∶1000稀释），TBST液冲洗4次×10 min，化学发光法显影。应用Image-Pro Plus软件分析条带灰度值，计算蛋白的相对表达量。

1.6.4  RT-PCR检测前列腺PI3K/Akt/mTOR通路mRNA表达

取前列腺组织于研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，重复3次，待研磨完全后，加入1 mL Trizol试剂提取组织总RNA，检测含量合格后按反转录试剂盒操作要求将RNA反转录成cDNA，扩增目的基因产物，条件：95 ℃、15 min预变性，95 ℃、10 s变性，60 ℃、30 s退火延伸，40个循环。反应结束后，计算Ct值，以2-ΔΔCt法分析各基因的相对表达量。引物由深圳华大基因公司合成，β-actin基因为内参，引物序列见表1。

1.7  统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间比较用方差分析，采用t检验。检验水准为α=0.05。

2  结果

2.1  益肾通淋方对模型大鼠前列腺指数的影响

与对照组比较，模型大鼠前列腺指数明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，各给药组大鼠前列腺指数均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表2。

2.2  益肾通淋方对模型大鼠前列腺病理形态的影响

对照组大鼠前列腺腺体分布均一，腺腔大小正常，腺上皮细胞排列整齐，无皱褶;模型组大鼠前列腺腺体多且密集，腺腔显著缩小，上皮细胞皱褶明显增多，间质变薄;各给药组大鼠前列腺腺体增生明显减少，腺腔有一定程度的扩张，腺上皮细胞皱褶基本消失，间质增厚，整体恢复良好，且高剂量组改善明显优于低剂量组。见图1。

2.3  益肾通淋方对模型大鼠前列腺PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠前列腺p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达均显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，除益肾通淋方低剂量组p-PI3K外，各给药组大鼠前列腺p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见图2、表3。

2.4  益肾通淋方对模型大鼠前列腺PI3K/Akt/mTOR信号通路mRNA表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠前列腺PI3K、Akt、mTOR mRNA表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，益肾通淋方高剂量组和阳性药组大鼠前列腺PI3K、Akt、mTOR mRNA表达显著下调，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表4。

3  讨论

BPH属中医学“癃闭”范畴，病机可用“肾气亏虚、湿热蕴结”概括，治当补肾益气、清热利湿。益肾通淋方中熟地黄、牛膝、菟丝子平补肾中阴阳以益肾填精，黄芪、丹参补气活血，土茯苓、金钱草利湿通淋，甘草调和诸药。诸药合用，攻补兼施，共奏补肾益气、清热利湿功效。

本研究采用去势术联合丙酸睾酮注射建立BPH模型，发现模型大鼠前列腺异常肥大，前列腺指数为正常大鼠2倍;病理切片显示，大鼠前列腺腺体多且密集，腺腔显著缩小，上皮细胞皱褶增多，细胞间质变薄。经益肾通淋方治疗后，模型大鼠前列腺指数显著下降，镜下观察发现腺体变少，腺腔扩张，腺上皮细胞皱褶基本消失，间质增厚，前列腺增生得到缓解。

PI3K/Akt/mTOR信号通路广泛存在于细胞中，在调节细胞生长、分化、凋亡等过程中起关键作用[7]。PI3K是PI3K/Akt/mTOR通路的上游启动分子，当细胞受到外界应激后，细胞膜上PI3K磷酸化成PIP3，PIP3可使Akt从胞质转移到胞膜，并使其Thr308位点磷酸化，活化的Akt一方面能自身发挥抑制细胞凋亡的功能，另一方面能激活其下游的mTOR分子，mTOR活化后，细胞抗凋亡能力进一步增加，同时促进细胞增殖[8-10]。据文献报道，PI3K/Akt/mTOR信号通路具有抑制前列腺癌细胞凋亡和促进其增殖、转移、侵袭及血管生成等作用，在前列腺癌的发生发展过程中扮演着关键角色[11]。本研究发现，BPH大鼠前列腺PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平及mRNA表达较对照组均明显升高，说明PI3K/Akt/mTOR通路过度激活，可能与腺体增加、腺腔缩小等病理现象有关;在益肾通淋方干预后，PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平及mRNA表达均明显改善，说明该中药复方能调控PI3K/Akt/mTOR通路，而这一过程可能与改善BPH大鼠前列腺增生有关。

综上，益肾通淋方能降低BPH大鼠前列腺指数，改善前列腺增生，其机制可能与抑制PI3K/Akt/ mTOR信号通路有关，本研究为其临床应用提供了依据。

参考文献：

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