活性维生素D3联合IFN-α对肝纤维化小鼠肝纤维化程度、IL-6、TNF-α、TGF-β及Smad3表达的影响

王乐 钱毅骏

在肝脏受到肝炎病毒感染或受损时，其中肝脏库普弗细胞可释放大量促炎性介质，如转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)等，使得肝星状细胞激活，使之处于活化状态，最终造成胶原的形成[1]。本研究通过构建四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠模型，探讨活性维生素D3联合α-干扰素(interferon-α，IFN-α)对小鼠肝纤维化程度及细胞因子表达的影响。

资料与方法

一、一般材料

实验动物：雌性BALB/c小鼠，6～8周龄，体质量15～25 g。

主要试剂与仪器：z480型实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)仪购自罗氏诊断公司，四氯化碳购自江苏南大光电材料股份有限公司，TRIzol试剂购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，酶联免疫吸附检测试剂盒购自南京金斯瑞生物科技有限公司，重组人IFN-α2b购自武汉艾美捷科技有限公司，活性维生素D3江苏佰耀生物科技有限公司。

二、方法

模型的构建及分组：经腹腔注射10%四氯化碳5 μL/g，每周3次，共注射2周，成功构建肝纤维化小鼠模型后，将小鼠随机分为阴性对照组(皮下注射0.9%生理盐水100 μL，隔日1次)、单药1组(口服灌胃活性维生素D3 50 μg/kg，隔日1次)、单药2组(皮下注射IFN-α 800 U，隔日1次)、联合组(给予活性维生素D3+IFN-α，用法与用量与单药组相同)，每组各5只，另选取5只小鼠为正常对照组(皮下注射0.9%生理盐水100 μL，隔日1次)。

肝纤维化的检查：采集各组小鼠肝脏组织，行组织病理学检查，对组织进行切片后行苏木精-伊红染色，并根据其严重程度进行分级[5]，分为0级：无纤维化，肝脏组织正常；Ⅰ级：存在纤维化，窦周与小叶内纤维化，汇管区纤维化增大；Ⅱ级：轻度纤维化，汇管区周围纤维化，形成纤维间隔，小叶结构无异常；Ⅲ级：中度纤维化，形成纤维间隔，且小叶结构异常，但未出现肝硬化；Ⅳ级：重度纤维化，形成纤维间隔且增厚，并出现诸多假小叶。

细胞因子含量的检测：通过双抗体夹心酶联免疫吸附法对各组小鼠肝细胞培养上清中的TGF-β、TNF-α及IL-6的含量进行检测，严格根据试剂盒说明书指示完成检测操作。

Smad3 mRNA表达的检测：对各组小鼠肝组织中的总RNA夹心提取，mRNA反转录为cDNA，之后行RT-qPCR。反应条件：95℃进行预变性30 s，以相同温度进行变性10 s，之后以60℃退火30 s，以相同温度进行延伸60 s，进行30个循环，并以β-actin作为内参。

三、统计学方法

结 果

一、组织病理学检查结果

阴性对照组肝索排列不齐，肝小叶结构异常，肝细胞水肿，出现炎性细胞浸润，汇管区出现诸多炎性细胞浸润且伴有纤维组织增生，脂肪变性明显，形成纤维间隔，伴有小叶结构异常；单药1、2组及联合组小叶结构未见破坏，但出现少量纤维间隔，汇管区纤维组织增生且出现少量炎性细胞浸润；正常对照组无炎性细胞浸润，肝索整齐排列，肝小叶结构正常，肝小叶间未出现纤维组织增生，汇管区未见纤维化。见图1。

二、肝纤维化分级结果

单药1、2组及联合组肝纤维化程度接近，无显著性差异；但阴性对照组肝纤维化程度较其它组明显加重。见表1。

表1 各组小鼠肝纤维化分级结果(例)

三、细胞因子的检测结果

结果显示，单药1、2组及联合组TGF-β和TNF-α含量较正常对照组明显升高，但较阴性对照组明显下降(P<0.05)；单药1、2组IL-6含量较其它组明显下降(P<0.05)，联合组IL-6含量较阴性对照组明显下降，但较单药1、2组明显升高(P<0.05)。见表2。

四、Smad3 mRNA的检测结果

结果显示，正常对照组、阴性对照组、单药1组、单药2组、联合组小鼠Smad3 mRNA表达水平分别为(1.02±0.03)、(3.08±0.82)、(0.67±0.22)、(0.66±0.24)、(0.70±0.25)。结果显示，单药1、2组及联合组Smad3 mRNA表达水平较正常对照组和阴性对照组明显下降(P<0.05)。

讨 论

活性维生素D3即为维生素的的活性形式，其对骨钙盐沉积及钙磷代谢具有重要的调节作用[2]。既往研究报道[3-4]，活性维生素D3对适应性及先天性免疫功能及其细胞的生成和分化具有重要的调节作用，且可阻滞心肌、肺、肝脏及肾脏纤维化的进展。已有研究表明[5-6]，IFN-α可通过调控肝脏细胞因子及免疫细胞水平直接起到抗纤维化的作用。活性维生素D3与IFN-α均可起到良好的抗纤维化作用，二者的相关机制存在一定的交叉重叠。本研究发现，单药1、2组及联合组肝纤维化程度接近，无显著性差异；但阴性对照组肝纤维化程度较其他组明显加重。并且，单药1、2组及联合组小叶结构未见破坏，但出现少量纤维间隔，汇管区纤维组织增生且出现少量炎性细胞浸润；而阴性对照组肝脏汇管区出现大量炎性细胞浸润。结果表明，单独或联合应用活性维生素D3与IFN-α均具有抗纤维化作用但联合应用不存在叠加效应。

注：A：正常对照组，B：阴性对照组，C：单药1组，D组：单药2组，E：联合组

组别nTGF-βTNF-αIL-6正常对照组520.09±5.134.87±0.3537.07±4.12阴性对照组5454.95±144.0515.09±3.2244.98±5.12a单药1组5378.97±86.23ab8.35±1.43ab18.97±3.22ab单药2组5372.14±97.58ab8.29±1.57ab18.88±2.95ab联合组5382.85±74.86ab8.14±1.63ab36.98±3.85bcdF96.4610.0316.97P<0.01<0.01<0.01

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与阴性对照组比较，bP<0.05；与单药1组，cP<0.05；与单药2组比较，dP<0.05

TNF-α具有诱导肝内纤维母细胞和Ito细胞增殖的作用，且可使之转化为肌纤维母细胞。IL-6可通过刺激炎性反应使得纤维化形成，同时可通过加强细胞外基质的合成而对肝纤维化的发生和发展起到促进作用[7]。本研究发现，单药1、2组及联合组TGF-β和TNF-α含量较正常对照组明显升高，但较阴性对照组明显下降；单药1、2组IL-6含量较其它组明显下降，联合组IL-6含量较阴性对照组明显下降，但较单药1、2组明显升高。结果表明，单独或联合应用活性维生素D3、IFN-α均可时肝纤维化小鼠肝内促炎性因子TNF-α与IL-6含量下降，但联合应用未能起到有效阻滞促炎性因子生成的作用，并且联合治疗后IL-6的疗效差于单独用药组。究其原因，可能因活性维生素D3与IFN-α联合治疗可能存在拮抗效应。

TGF-β、肝星状细胞活化、基质金属蛋白酶及其组织抑制因子均在肝纤维化的发生及发展中发挥重要作用，且上述因素具有相互调节作用，可形成复杂的系统[8]。TGF-β是促进组织纤维化形成的主要因子之一，其可诱导细胞外基质合成，并且对细胞外基质的降解具有抑制作用[9]。活化的肝星状细胞具有表达促纤维化关键因子的受体的作用，如TGF-β1及血小板驱动生长因子等，可进一步促进相关信号通路的激活[10]。在发生肝纤维化时，Smad3可作为一种细胞内主要信号传导介质，作为调控肝纤维化进展的主要因素，其可将信号由胞质传至细胞核内，对目的基因的表达具有调控作用，并且可诱导胶原合成，活化肝星状细胞[11]。据报道[12]，活性维生素D3与IFN-α可通过TGF-β/Smad3通路起到阻滞肝纤维化发生及发展的作用。本研究发现，单药1、2组及联合组Smad3 mRNA表达水平较正常对照组和阴性对照组明显下降。结果表明，无论是单独应用活性维生素D3、IFN-α，亦或是联合治疗均可促使肝纤维化小鼠肝内TGF-β含量及Smad mRNA表达水平降低。结果提示，活性维生素D3与IFN-α单独或联合治疗均具有良好的疗效，但联合治疗并无叠加效应。

综上所述，活性维生素D3、IFN-α单独或联合治疗肝纤维化小鼠具有相似的临床疗效，联合治疗并无叠加效应。由于TGF-β/Smad3通路活化可有效促进肝纤维化的形成，因此通过阻断此通路可能是治疗肝纤维化的潜在靶点。