精子形态学特定缺陷与运动特征的相关性研究

沈丽燕 余怡 王家雄 杨慎敏 王玮 李红

精子的形态学评估是精液分析的一个重要组成部分，精子形态与精子功能的关系已经被很多报道所证实。精子头部与精子染色质结构密切相关，其缺陷会影响体外受精和体内受精的结局[1]，精子中段的缺陷也会影响辅助生殖的结局[2]，因此，精子形态评估已经被用于确定男性精子的受精潜能以及预测辅助生殖的结局[3]。然而即使如此，精子形态评估的价值和必要性仍受到质疑[4]。有研究者发现不同的染色和洗涤程序会对人类精子形态评估结果有明显影响[5]。随着辅助生殖技术，尤其是卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技术的发展，精子形态学评估对那些有意接受体外受精的夫妇来说似乎变得不那么重要[6]。尽管精子形态能够反映精子的受精能力，但检测的精确度高度依赖于形态学缺陷的标准化分类和严格的质量控制[7]。本研究对具体的精子形态缺陷与其运动参数的相关性进行分析，旨在确定各种缺陷对精子运动参数是否有预测价值。

对象和方法

1.对象：2014年7月—2016年11月间于南京医科大学附属苏州医院生殖与遗传中心接受检查的男性3 775名，平均年龄(29.7±2.4)岁。纳入研究患者均为健康男性，无严重慢性病史，排除了精液不完全液化，高粘度和精子凝集的样本，以减少影响结果的因素。研究获得我院伦理审查委员会的批准，知情同意书患者书面签字。

2.标本收集和检测：

(1)精液的收集处理：患者禁欲2～7 d后，通过手淫采集精液样本，置于37 ℃培养箱液化60 min后进行分析。

(2)精液常规参数分析：根据世界卫生组织指南提出的标准方法进行精液评估[8]。精液参数包括：精液体积、精子浓度、前向运动精子百分率(WHO等级a + b合并)、活动精子百分率、运动速度有效精子浓度(Functional Sperm Concentration，FSC)(106/ mL)。通过计算机辅助精子分析(computer-aided sperm analysis ，CASA)仪器进行评估。评估后，按照世界卫生组织指南中指出的浓度和体积正常值的临界值，排除异常浓度(<15×106/ ml)和体积(<1.5 mL)的标本，以防止它们对精子运动参数的影响。

(3)精子形态分析：精子涂片采用改良的巴氏法染色，1000倍油镜观察精子形态。检查200个精子，重复两次。根据WHO标准评估形态学正常和异常精子的百分比。另外，在形态异常的精子中，监测各类具体的头部[锥形、梨形、圆形、不规则、空泡(超过2个空泡，或空泡区域占头的20%以上)、顶体后区空泡、大顶体(顶体区域占头的70%以上)、小顶体(顶体区域占头的40%以下)、大头、小头、 双头]，颈部(异常粗、弯折、非对称性插入、异常细、不规则)，尾部缺陷(短、多尾、发卡样弯曲、断裂、成角弯曲、卷曲)和胞浆残余体的百分比。

结果

经过筛选后我们获得2 883个可用样本。精液平均浓度为(59.4±37.5)×106/ mL。表1显示了标准精子参数和每个形态学缺陷的百分比。

研究发现精子形态缺陷与精子运动参数有关。如表2所示，锥形头的精子速度较低，头部梨状可能导致前向运动精子百分率、速度和FSC下降。圆头会影响精子的前向运动和FSC，同时速度和FSC会因为不规则头部增多而减少。另外，顶体小的精子会影响所有四个运动参数。根据本研究数据，弯曲的尾巴会影响FSC。此外，颈部弯折，卷尾和短尾的百分比与活动精子百分率呈显著负相关。有趣的是，颈部异常粗与精子活力显示出意想不到的正相关。其余缺陷与这四个运动参数未呈现相关性。

绘制不同形态缺陷百分比的ROC曲线，大部分ROC曲线与相关分析结果相符。本研究发现用短尾异常精子所占百分数评价运动速度是否异常的AUC最大。而尾部卷曲评价活动精子百分率和前向运动精子百分率AUC在所有曲线中最大。

表2 精子运动特征与精子形态异常相关性

△表中未列出的形态学缺陷与精子运动参数无显着相关性。*P<0.05;**P<0.01；“-”：负相关；“+”:正相关；NA：无数据

表3 不同缺陷评价运动参数ROC曲线的曲线下面积

讨论

精子形态学评估可用于评估精子质量和受精能力。评估的准确性高度依赖于标准的合理性。由于精子形态是临床医生较为感兴趣的精液参数之一[9]世界范围内逐渐出现了很多不同的畸形分类标注：MacLeod J[10],Bisson JP[11]，Jouannet P[12]等人相继推出了行之有效的判断标准，随后Kruger TF等[13]在严格形态学标准的基础上提出自己的精子分类，并被临床实验室迅速广泛应用。最后，世界卫生组织提出统一的分类标准，该标准被认为比旧标准更可靠[14]。根据世界卫生组织的标准，精子形态学缺陷可分为头部缺陷，颈部或称中段缺陷、主段缺陷和胞浆残余体(excess residual cytoplasm，ERC)四部分。前三部分可以细分为多个类别。尽管精子形态学缺陷经常被报道与精子活力密切相关，但迄今为止还很少有关于详细缺陷与活动性之间关系的研究。

在本研究中，发现不同的精子形态缺陷与活动精子的运动参数之间存在关联。本研究观察到具有锥形头部的精子倾向于具有较低的速度。Andrade-Rocha FT[15]的研究发现精索静脉曲张男性表现出类似的活力受损，活动性随着锥形头部精子的增加而降低。此外，本研究结果还表明，具有梨状头的精子可能与较低的强向运动精子百分率、速度和FSC有关。Rousso等[16]2002年的报道声称梨形头虽然不能妨碍尾巴移动，但是具有梨形头的精子的其它部位总是比正常头部的精子更频繁地出现异常，这可能潜在的影响精子的运动参数。本研究还观察到，圆形和无定形头部的精子也可能使精子活力异常。Liao等[17]认为，圆形精子中外层致密纤维蛋白2的表达水平较低，而这直接影响精子鞭毛的超微结构，可能解释圆头精子的低运动性。Sivanarayana T等[18]的研究表明头部异常，包括无定形头部，与染色质堆积异常和DNA碎片发生率较高有关，这可能导致精子活力降低。此次研究结果表明顶体小的精子运动异常，小顶体区域是由于精子头部发育不良造成的，这可能会降低精子活力。总之，本研究认为引起头部异常的可能是遗传缺陷，也可能是活性氧[19]，而头部缺陷可能意味着DNA或染色质结构的异常，而这些都已被证明对精子活动能力有负面影响[20]。此外，不规则的头部形状也可能会阻碍精子的运动。

Hu Y等的研究证实，颈部弯折与精子活动力呈负相关，他们发现弯曲中段精子的低运动性和降低的Galpha12表达有关[21]。有趣的是，本研究结果显示，颈部异常粗与动力呈正相关。线粒体是精子运动的主要能量提供者，而线粒体鞘主要分布在精子的中间部分[22]，据报道线粒体鞘的紊乱与弯曲的颈部相关[23]。因此，本研究将颈部弯折引起的异常运动归咎于异常的线粒体鞘，这可能导致提供的能量减少。同样的，本研究推测异常粗中段拥有线粒体较多的线粒体鞘。因此，关于中段异常粗带来的运动性增加的原因，怀疑是线粒体鞘提供更多能量的结果，不过仍有待研究。

精子尾部鞭毛是精子活动的重要组件，其畸形与精子活动力有着直接的联系，最主要原因可能就是尾部鞭毛畸形不仅仅是外部形态的异常，往往还涉及内部微管等动力组件超微结构的紊乱。临床有一类病症为精子鞭毛多发性形态异常(multiple morphological abnormalities of the sperm flagella,MMAF)，其表现为大多数精子不运动或活动力较低，而精子尾部出现严重的结构畸形，其中就包括尾部短、卷曲、弯折以及粗大[24]。本研究发现精子尾部成角弯折多，会降低精液的FSC，这一现象在其他研究中从未被提及过，FSC是CASA系统通过活动力计算出的一个指标，FSC降低意味着精子的活动力差。在Chao HC[25]等的报道中，发现尾部弯折和SEPTIN7蛋白编码基因丧失有关，而SEPTIN蛋白与许多微管相关蛋白有相互作用，鞭毛组装的异常严重影响精子活力。短尾精子一直是我们课题组关注的重点，其百分率增多会影响精子活力。另外，尾部卷曲和运动参数之间也观察到显著的负相关。Yeung CH等[26]也做过类似的报道，指出尾部卷曲精子百分比与前向运动精子率之间显著的负相关性。

综上所述，详细的精子形态学缺陷的各个部分与精子活力密切相关，具有一定的临床参考价值。尽管如此，其应用还需要进一步改进，以更好地反映精子活力，为精确的受精潜力临床评估提供参考。