稽留流产患者绒毛组织中TNF-α、NF-κB以及caspase-3的表达及其相关性
2019-09-02毕颖董明慧刘晓丽陈湘玲王维香
毕颖 董明慧 刘晓丽 陈湘玲 王维香
胚胎或是胎儿已经死亡且滞留在宫腔内未能及时自然排出的情况在临床上称之为稽留流产(missed abortion,MA),近些年相关研究报道称,MA的发病率呈上升趋势;也因此引得临床上的重视[1]。在MA发病因素的相关分析[2]中发现,感染与MA的发生有重要关系。报道[3]称,病原菌感染引起的子宫内膜炎症会使得巨噬细胞和淋巴细胞释放一系列的细胞因子如肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)、白细胞介素1-β等,从而刺激k基因结合核因(nuclear factor-k-gene binding,NF-κB信号通路激活,进一步增强细胞炎症反应和促进局部免疫功能失衡。肿瘤坏死因子的升高还会诱导细胞的凋亡,而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)是细胞凋亡中最重要的终末剪切酶,两者可能存在一定的相关性。因此,本研究对比稽留流产患者与对照组流产后绒毛组织中TNF -α、NF-κB以及caspase-3的表达变化,并分析三者之间的相关性。现报告如下。
资料与方法
1.研究对象:将2016年1月—2017年1月本院收治的30例早期稽留流产患者纳入研究,为稽留流产组;选择同期在本院自愿要求终止妊娠的正常妊娠早期妇女30例为对照组。患者年龄为27~31岁,平均年龄为(27.9±2.2)岁,平均停经时间为(62.4±6.1)d;二组患者的一般临床资料无统计学差异(P>0.05),具可比性。
2.病例纳入排除标准:根据《妇产科学》(第7版)的稽留流产诊断标准确诊稽留流产者;所有研究对象既往月经规律,均无宫内节育器、生殖道发育异常、明显感染及重要脏器疾病史,近3个月内未使用过任何激素类药物、无外伤及毒物放射线接触史、无遗传史。对照组无流产、死胎、死产等不良孕产史;所有入选研究对象对本研究知情同意。
3.方法:收集以上研究对象的绒毛组织,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)测定其中TNF-α、NF-κB、caspase-3 mRNA的表达;酶联免疫吸附法(ELISA)测定TNF-α、NF-κB、caspase-3蛋白的表达情况,具体步骤如下。
(1) 主要试剂:Trizol试剂和两步法RT-PCR试剂盒购自北京全式金生物技术公司,TNF-α、NF-κB以及Caspase-3 ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程公司,引物由北京三博远志生物技术公司合成。
(2) 标本的采集及保存:负压吸引术吸出孕囊后,立即分离出绒毛组织,无菌生理盐水冲洗干净,即刻分装于经焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理过的2 ml冻存管中,15 min内置于80℃低温冰箱中保存。l份用于RT-PCR,另1份用于EL1SA检测。
(3)RT-PCR反应:用Trizol试剂提取绒毛组织的总RNA。每个标本分别提取RNA进行逆转录反应,cDNA的合成严格按逆转录试剂盒说明书进行。NF-KB上游引物为5′-CCTGGATGACTCTTGGGAAA-3′,下游引物为5′-TCAGCCAGCTGTTTCATGTC-3′,扩增产物长度358bp;TNF-α上游引物为5′-TCAGAGGGCCTGTACCCTCAT-3′,下游引物为5′-GGAAGACCCCTCCCAGATAG-3′,扩增产物长度313 bp;caspase-3上游引物为5′-GTCGAGTCCAGTCCAAGTCCAT-3′,下游引物为5′-ACGTGGTCAACCGTCGACCTTG-3′,扩增产物长度为205 bp;内参照β肌动蛋白(β-actin)上游引物为5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′,下游引物为5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′,扩增产物长度104 bp。反应体系为50 ul,其中5 U/td DNA聚合酶1 ul、上游引物1 ul、下游引物1 ul、2.5 mmol/L三磷酸脱氧核苷(dNTP)4 ul、cDNA 2 ul、10×缓冲液5 ul、DEPC 36 ul。反应条件:TLR-4和NF-κB:94℃ 5 min (94℃ 30 s+56℃ 35 s+72℃ 2 min)×35+(72 ℃ 10 min:HBD-2:94℃5 min}(94℃ 30 s}(59℃ 35s}72℃ 2 min)×35+72℃ 10 min;β-actin:94℃ 5 min (94℃ 30 S+62℃ 35s72℃ 2 min)×35+72℃ 10min。取3 L PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳,采用凝胶成像系统对电泳情况进行分析,并取摄图像供Quantity One图像分析软件分析其灰度值。实验中目的基因mRNA的相对表达水平=目的基因条带的灰度值/β-actin条带灰度值。
(4)ELISA试验:采用ELISA(固相夹心法)测定绒毛组织中TNF-α、NF-κB、caspase蛋白的表达水平。绒毛组织中加入无菌生理盐水(1 g绒毛组织加9 ml无菌生理盐水)进行匀浆后,依次按ELISA试剂盒说明书进行操作。
结果
1.两组TNF-α、NF-κB、caspase-3 mRNA表达情况比较:在稽留流产患者的绒毛组织中TNF-α、NF-κB、caspase-3 mRNA的表达水平分别为(3.2±0.3)(2.5±0.3)(0.2±0.0),均显著高于正常对照组(1.0±0.3、1.0±0.2、0.1±0.0),差异有统计学意义(P均<0.05);见表1。
表1 2组TNF-α、NF-κB、caspase-3 mRNA表达情况比较
注:两组比较,*P<0.05
2.两组TNF-α、NF-κB、caspase蛋白的相对表达情况比较:稽留流产组与对照组各蛋白含量比值进行比较(表2),稽留流产患者的绒毛组织中TNF-α、NF-κB、caspase-3 蛋白水分别为(0.5±0.0)(0.4±0.0)(0.9±0.2),均明显高于对照组,差异有统计学意义(P均<0.05)。
表2 2组TNF-α、NF-κB、caspase-3蛋白相对表达情况比较
注:两组比较,*P<0.05
3.TNF-α、NF-κB、caspase-3表达的相关性Person分析:Person分析结果显示,TNF-α与NF-κB的表达成正相关(r=0.415,P<0.05);TNF-α与caspase-3表达呈正相关(r=0.628,P<0.05)。
讨论
MA是一种特殊的自然流产类型,也属于病理性流产,指的是胚胎或是胎儿已经死亡且滞留在宫腔内未能及时自然排出的情况[4]。对MA的病因研究[5]发现,胚胎因素、免疫系统因素、感染等生理因素以及环境、社会等外界因素均会引起稽留流产的发生;其中,感染因素在近年来越来越受到临床上的重视。有研究认为,病原菌感染引起的子宫内膜炎症会使得巨噬细胞和淋巴细胞释放一系列的细胞因子如肿瘤坏死因子、白细胞介素1-β等,从而刺激NF-κB信号通路激活,进一步增强细胞炎症反应和促进局部免疫功能失衡[6];且当TNF-α水平过高时,会诱导滋养细胞的凋亡,细胞表面绒毛组织的减少,导致组织水肿、细胞受损[7]。TNF-α是由巨噬细胞产生并在生物组织中广泛表达,是一种具有多种生物学活性的细胞因子。研究[8-9]证实,一定水平的TNF-α可对妊娠期机体产生有利的促胚胎发育作用,同时可以改善孕体能量代谢、维持妊娠,主要因为TNF-α可促进机体内合成更多的孕激素及绒毛组织促性腺激素,其在刺激细胞滋养层生成尿激酶型纤溶酶原激活剂的同时,有利子宫蜕膜组织外基质降解及胎盘植入。NF-κB是一种核转录因子,主要参与调控机体免疫、炎症、细胞增殖分化及凋亡等相关基因的转录,尤其是免疫与炎症反应。研究[10]认为,MA患者绒毛组织滋养层细胞的凋亡增加是引起MA的重要病理过程。Caspase-3是细胞凋亡中最主要的一种剪切酶,经激活后的Caspase-3可裂解大量的底物,诱导细胞的凋亡[11]。因此,在本研究中通过蛋白定量技术、ELISA等测定TNF-α、NF-κB、caspase mRNA及蛋白的表达,判断在稽留流产患者人群中TNF-α、NF-κB、caspase-3变化的意义;并通过Person分析确定TNF-α、NF-κB、caspase-3在稽留流产表达中的相关性。
在本研究中,RT-PCR结果显示,在稽留流产患者的绒毛组织中TNF-α、NF-κB、caspase-3 mRNA的表达水平均显著高于正常对照组。ELISA测定结果显示,稽留流产患者的绒毛组织中TNF-α、NF-κB、caspase-3蛋白表达水平均明显高于对照组。这提示了炎症因子在稽留流产的病理过程中有重要作用,且与炎症通路和细胞凋亡相关。此外,Person分析结果显示,TNF-α与NF-κB的表达成正相关,与caspase-3的表达亦呈正相关。出现这一结果的可能原因如下:(1)当母体免疫功能异常或炎症反应诱使巨噬细胞释放TNF-α增多,使得TNF-α水平表达增加;(2)上升的TNF-α水平激活NF-κB信号通路,使NF-κB表达上调;而NF-κB会进一步的加重炎症反应,导致TNF-α的释放增加;(3)TNF-α水平过高时,会诱导滋养细胞的凋亡;研究认为,caspase-3的表达与滋养细胞的凋亡密切相关,当caspase激活时会促进滋养层细胞的凋亡,促进流产的发生[12-13]。因此,本研究提示,TNF-α水平和caspase-3的表达过高导致的滋养细胞凋亡,促进流产的发生;进一步分析则显示,体内炎症反应的发生促使TNF-α的高表达,即体内炎症导致的TNF-α的高表达与caspase激活(表达增加)共同促进滋养层细胞的凋亡,导致流产。
综上所述,在稽留流产患者的绒毛组织中TNF-α、NF-κB、caspase-3 mRNA及蛋白的表达含量均会增高,这提示稽留流产的发生与患者体内的炎症反应及滋养层细胞过度凋亡可能存在相关关系;但是三者之间的具体作用机制,仍待进一步的研究。