含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶10在压力超负荷诱导的心肌肥厚中的表达及其与心肌纤维化的关系

王震，王梦龙，刘剑芳，叶晶，徐瑶，姜慧敏，叶迪，张记收，万军

心肌肥厚是心脏应对机械及神经体液等多种刺激产生的适应性改变，是高血压、心脏瓣膜病、心肌梗死及先天性心脏病等多种心血管病的共同病理生理过程，其主要病理变化包括心肌细胞体积增大、细胞外基质（ECM）合成增多和胶原沉积等[1-2]。含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶（ADAMTS）家族是一类新型的分泌型金属蛋白酶，参与血管形成、排卵、炎症反应和止血等生理过程。多项研究表明，ADAMTS家族参与调控多种心血管病，包括动脉粥硬化、心肌梗死、心脏瓣膜病和心力衰竭等[3-4]。本研究拟通过主动脉弓缩窄术（TAC）建立小鼠心肌肥厚模型，探讨ADAMTS10在心肌重构病理生理过程中的作用，为防治心肌肥厚及纤维化提供理论依据和治疗的新靶点。

1 材料与方法

实验材料: SPF级C57BL/6J雄性小鼠60只，8～10周龄，体质量（25.0±2.0）g，由武汉大学心血管病研究所提供，许可证号：SYXK（鄂）2009-0053。饲养在武汉大学心血管病研究所动物房小鼠微屏障饲养系统，给予充足的喂食和水，待小鼠适应环境后，利用计算机生成随机数字表，采用随机数字法随机分为假手术组（n=20）和实验组（n=40）。

试剂和仪器：主要试剂：二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（Thermo Fisher公司，美国）；ADAMTS10（ab173290）、波 形 蛋 白（Vimentin，ab92547）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH, ab8245）抗体均购自Abcam公司（英国）；二抗（LI-COR公司，美国）；TRIzol试剂和反转录试剂盒（Roche公司，瑞士），其余试剂为国产分析纯。主要的实验仪器有：超声裂解仪、研磨仪、包埋机、超高速离心机、分光光度计、酶标仪、烤箱、水浴锅、脱水机、病理切片机、蛋白/核酸电泳仪、转膜槽、摇床、封膜机、双色红外荧光成像系统、倒置荧光显微镜、实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测仪、MyLab30CV型超声仪（Biosound Esaote公司，意大利）。

心肌肥厚模型的建立：由本实验室专职工作人员负责造模，操作步骤如下：（1）实验组小鼠的制备：3%戊巴比妥钠溶液（30 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠后，备皮，将小鼠仰卧位固定在操作台上，套管针气管插管后用小动物呼吸机辅助呼吸。在胸骨左缘2～3肋间做一横行切口，依次分离皮肤、肌肉及软组织，打开胸腔，用显微镊游离主动脉弓。将7-0结扎线穿过主动脉弓，同时平行主动脉弓放置一去尖的26/27 G针头，将主动脉弓与针头一起结扎，然后迅速抽出针头，逐层关胸。（2）假手术组小鼠：只穿线，不结扎，其余步骤同前。

检测心功能和血压：分别于术后4周和8周检测小鼠心脏功能。1.5%异氟烷吸入麻醉小鼠，备皮，涂抹耦合剂，仰卧位对小鼠行心脏超声检查，探头频率10 MHz。选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量并记录左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（LVFS）。

组织病理学检测：称量并记录小鼠体质量，其中实验组小鼠于第4周和第8周处死，取出心脏，放入10% KCl溶液中洗掉血液，称量并记录小鼠心脏质量。将心尖部分迅速放入液氮中保存，之后转移至-80℃冰箱保存备用。其余左心室组织进行多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片。切片进行苏木素-伊红染色法（HE）、天狼猩红和麦芽胚凝集素染色（WGA），显微镜下观察并拍片，使用image pro plus 6.0软件计算心肌细胞横截面积和左心室胶原分数。

免疫荧光检测：切片进行抗原修复后，磷酸盐缓冲液漂洗3次，之后用2%小牛血清白蛋白封闭30 min。轻轻甩掉封闭液，在切片上分别滴加适当的抗体，平放于湿盒内4℃孵育过夜。切片洗涤3次后二抗孵育10 min，随后4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液复染细胞核。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察并采集图像。

心肌组织信使RNA（mRNA）表达的检测：于-80℃冰箱取出样本，TRIzol法提取总RNA，分光光度计测定RNA浓度，计算RNA提取量，将总RNA逆转录为cDNA。构建PCR反应体系，利用罗氏Lightcycler480 Real-time PCR仪进行扩增，反应条件为：95℃预变性10 min；95℃变性10 s、60℃退火10 s、72℃延伸20 s，共40个循环。以GAPDH作为内参，采用2-△△Ct法对结果进行定量分析。利用Primer-BLAST在线设计引物，特异度引物序列由北京擎科新业生物技术有限公司合成，特异性引物序列见表1。

表1 特异度引物序列

心肌组织蛋白表达水平检测：取适量心肌组织，按10 mg/100 μl反应体系加入裂解液，提取蛋白，BCA法进行定量。制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，按40 μg/孔道上样电泳，待电泳结束后取出凝胶，湿转法转膜后用5%脱脂奶封闭1 h，加入适量一抗（anti-ADAMTS 10，1:1 000稀释）4℃孵育过夜，随后二抗孵育1 h，双色红外荧光成像系统扫膜，以GAPDH为内参分析和计算相关蛋白表达水平。

统计学方法: 采用SPSS 22.0软件进行统计学处理。计量数据以均数±标准差（s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两变量间相关分析采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两组小鼠心功能比较（表2）：假手术组2只小鼠出现麻醉意外，实验组4周和8周各有2只不符合心肌肥厚标准，剔除出实验组。实验组与假手术组相比， 4周小鼠心脏质量明显增加（P＜0.05），且在实验组第8周进一步升高（P＜0.05）；超声结果表明，与假手术组比较， 实验组4周小鼠LVEF和LVFS均显著降低（P＜0.05），且在实验组8周进一步降低（P＜0.05）。

表2 两组小鼠心功能比较（

表2 两组小鼠心功能比较（

注： BW：体质量；HW：心脏质量； LVEF：左心室射血分数；LVFS：左心室短轴收缩率。与假手术组比较aP＜0.05；与实验组4周相比bP＜0.05

项目 假手术组(n=18) 实验组4周(n=18) 8周(n=18)BW (g) 27.6±2.4 26.6±1.7 27.3±2.9 HW (mg) 120.1±9.6 156.1±11.3a 187.9±10.6b LVEF (%) 79.6±4.1 62.2±3.5a 50.4±4.3b LVFS (%) 41.2±2.3 33.6±3.1a 28.5±3.2b

两组大鼠心肌组织ADAMTS10 mRNA和蛋白表达的比较（图1、图2）：与假手术组相比， 实验组4周小鼠心肌组织ADAMTS10 mRNA和蛋白表达上调（P＜0.05）；实验组8周与实验组4周小鼠比较， 8周小鼠的心肌组织ADAMTS10 mRNA和蛋白表达又进一步上调（P＜0.05）。

ADAMTS10在心肌组织中定位（图3）：免疫荧光染色结果提示：ADAMTS10与心肌成纤维细胞标志物波形蛋白（Vimentin）共表达，ADAMTS10定位于心肌成纤维细胞。

图1 两组小鼠心脏组织中ADAMTS10 mRNA表达情况（n=18）

图2 两组小鼠心脏组织中ADAMTS10蛋白表达情况（n=18）

图3 ADAMTS10在小鼠心肌组织中的定位

心肌组织ADAMTS10与心肌肥厚的相关性分析：病理染色显示，实验组与假手术组相比，心肌细胞横截面积增大，且相较于实验组4周，实验组8周小鼠心肌细胞横截面积进一步增大，心肌肥厚程度进一步加重（P＜0.05，图4）。实验组4周与8周小鼠心肌组织ADAMTS10 mRNA水平与心房钠尿肽（ANP）、β-心肌肌球蛋白重链（β-MHC）的mRNA水平呈正相关（P＜0.05，图5）。

图4 小鼠心脏组织HE和WGA染色结果（X400）及心肌细胞横截面积

图5 实验组小鼠心脏组织中ADAMTS10 mRNA与ANP mRNA和β-MHC mRNA水平的相关性分析（n=18）

心肌组织ADAMTS10与心肌纤维化相关性分析:天狼猩红染色显示，实验组小鼠心肌胶原增加，且相较于实验组4周，实验组8周小鼠心肌胶原进一步增加，纤维化程度进一步加重（P＜0.05，图6）。实验组 4周和8周小鼠心肌组织ADAMTS10 mRNA水平与MMP2、MMP9的mRNA水平呈正相关（P均＜0.05，图7）。

图6 小鼠心脏组织天狼猩红染色结果（X400）

图7 实验组小鼠心脏组织中ADAMTS10 mRNA与MMP2 mRNA和MMP9 mRNA水平的相关性分析(n=18)

3 讨论

心肌肥厚是心脏应对各种损伤时产生的一种代偿机制。在组织器官水平表现为室壁增厚、室壁顺应性下降；细胞水平表现为心肌细胞肥大，基质细胞增殖导致大量胶原沉积；分子水平表现为肥厚相关基因的激活、肌节组装和蛋白质合成增加[5-7]。在心肌肥厚早期，心肌细胞体积增大，胶原纤维大量合成以维持心脏的正常形态完整性和功能，但持续的心肌肥厚可降低心肌顺应性和心脏功能，从而改变心脏血流动力学，导致心力衰竭、心律失常甚至猝死的发生。本研究通过TAC术建立小鼠心肌肥厚模型，术后4周和8周的小鼠心脏质量明显增加，超声提示小鼠心功能下降，组织病理学结果表明实验组小鼠心肌细胞横截面积增加，间质胶原蛋白大量沉积，且分布紊乱，与本实验室既往研究成果基本一致[8]，表明本研究成功建立了压力负荷致心肌肥厚模型。

ADAMTS是一类多结构域基质相关性锌指金属蛋白酶，包含19个家族成员，具有相似的结构基础，包括解素样结构域、金属蛋白酶催化结构域、I型血小板结合蛋白富集区域和重复序列等[9]。ADAMTS分子结构及蛋白水解作用与基质金属蛋白酶家族类似，调节ECM的合成与水解。自ADAMTS家族发现以来，大量研究表明其与心血管病的发生发展密切相关。Wu等[10]的研究表明，心肌梗死患者血浆ADAMTS7水平与心室重构程度和预后相关，可作为心肌梗死患者心力衰竭的独立危险因素。而Krishnamurthy等[11]发现，在小鼠弹性蛋白敲除诱导的主动脉瓣膜病模型，ADAMTS5、MMP2和MMP9表达上调，ADAMTS5通过促进多功能蛋白聚糖异常降解，加快胞外基质重塑，最终导致主动脉瓣畸形和瓣膜病的发生。最近的研究表明，ADAMTS10与纤维蛋白1共定位在人类皮肤，同时与纤维蛋白1相互作用，促进其在皮肤成纤维细胞的细胞外基质中沉积[12]。本研究结果证实ADAMTS10在小鼠心肌组织表达，且定位在心脏成纤维细胞，那么ADAMTS10是否参与心肌肥厚调节？是否和心肌纤维化有关系呢？

ADAMTS10最早于小鼠胚胎中被发现，主要在肺、肾和骨中表达，具有与其他成员相似的结构，区别在于其C端存在5个特征性I型血小板结合蛋白重复序列[13-14]。研究表明，ADAMTS10基因变异可导致Weill-Marchesani综合征，是一种罕见的结缔组织病，也称球形晶状体短指畸形综合征，反马凡综合征等[15]。Wang等[16]证实在异丙肾上腺素诱导的离体实验模型中，ADAMTS2的表达上调，且沉默ADAMTS2的表达可减轻异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大。与之类似，本研究使用RT-PCR和Western blotting检测ADAMTS10在实验组4周和8周小鼠心肌组织的表达情况，结果表明随着病程的持续，在心肌细胞肥大和心肌纤维化进行性加重的同时，ADAMTS10含量也呈进行性增加。ANP和β-MHC是心肌肥厚严重程度的指标，本研究发现心肌肥厚小鼠心肌中ADAMTS10 mRNA水平与ANP mRNA和β-MHC mRNA水平均呈正相关。心肌纤维化是心肌重构的重要组成部分，MMP过度降解正常胶原蛋白，导致ECM重构，可作为反映心肌纤维化程度的指标。本研究发现ADAMTS10 mRNA水平与MMP2 mRNA和MMP9 mRNA水平明显正相关。因此推测压力负荷诱导心肌组织ADAMTS10表达上调，继而升高的ADAMT10通过调节ECM的动态平衡参与心肌肥厚和纤维化的发生。

局限性：本研究仅做了相关性分析，未能进一步探究ADAMTS10调控ECM重构的具体分子机制，这也是下一步实验的重点研究内容。本文的亮点：初步证实了ADAMTS10在心肌组织表达，并定位在心肌成纤维细胞。其次，证实在压力负荷刺激下，ADAMTS10通过调控ECM重构，参与心肌肥厚和纤维化的发生发展，提示ADAMTS10可能是逆转心肌肥厚及纤维化的重要靶点。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突