15个大花序桉品种的AFLP分析

孙雪阳，庞贞武，黄汉宁，秦 丽

(1.广西国有东门林场，广西 扶绥 532108；2.广西八桂林木花卉种苗股份有限公司，广西 南宁 530024)

1 引言

大花序桉(Eucalyptuscloeziana)为桃金娘科(Myrtaceae)桉树属(Eucalyptus)伞房亚属(Corymbia)树种，原产于澳大利亚，位于南纬16°～26.5°，分布不连续，主要分布在昆士兰南部[1]。其木材纹理通直、硬度高、呈黄褐色，锯材性能优良、价值高，广泛用于家具、建筑等，实木利用前景广阔[2]。我国于1972年引种大花序桉，从20世纪80年代起，广西陆续从澳大利亚引种不同种源的大花序桉种植。近年来，随着人们对优质木材的需求上升，大花序桉因其速生性以及优良材性进入了人们的视线。但目前市面上苗木较杂，为弄清它们之间的关系，笔者选取了部分实生苗、组培苗以及种源试验林、母树林单株进行AFLP分子标记，以期验证它们之间的亲缘关系，弄清苗木来源。

2 材料和方法

2.1 材料

15个大花序桉样品分别采自广西国有东门林场中心苗圃、大花序桉母树林、种源试验林、广西八桂林木花卉种苗股份有限公司三塘苗圃以及合山市柳花岭林场试验林等地点。于晴朗天气，选取健壮、无病虫害植株嫩叶5～10片，放在装有变色硅胶的封口袋中干燥后，放入-20 ℃低温冰箱中保存备用。

2.2 试验方法

本次试验选用AFLP((Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性)分子标记。该标记方式是对基因组总DNA双酶切后经PCR进行选择性扩增，由于不同来源DNA的酶切片段存在差异，因而产生了扩增产物的多态性[3]。试验过程主要包括DNA的提取(CTAB法)、限制性酶切及酶切片段连接、预扩增、选择性扩增、凝胶电泳，具体步骤参考相关文献[4，5]进行。试验中预扩增引物使用EcoRI: 5’> GAC TGC GTA CCA ATT CA< 3’，MseI: 5’> GAT GAG TCC TGA GTA AC<3’。选择性扩增引物EcoRI-AAC、AAG、ACA、ACT、ACC、ACG、AGC、AGG(5ng/μL)8种，MseI-CAA、CAC、CAG、CAT、CTA、CTC、CTG、CTT(30ng/μL)8种，两两组合，共64对引物。

表1 供试材料和来源

2.3 数据分析

通过GENESCAN软件打开胶图进行分析，软件每2个碱基读取一次，Marker片段范围为 70～500 bp，每对引物读取216条条带，得到原始数据。由于AFLP是显性标记，即同一对引物组合扩增产物中电泳迁移率一致的条带具有同源性[6]，因此可在原始数据的基础上，进行转换，有数值记作“1”，无数值则记为“0”，从而生成由“l”和“0”组成的原始矩阵。用NTSYSpc-2.11F软件进行数据分析。对原始矩阵用SimQual程序求相似系数矩阵，并获得相似系数矩阵。用UPGMA法对得到的相似系系数矩阵进行聚类分析。

3 结果

采用改良CATB法提取DNA，电泳检测DNA条带清晰(图1)，满足AFLP标记要求。进行EcoRI/MseI双酶切，所获片段在胶板上分布均匀，多态性十分丰富。从64对引物中筛选出8对条带清晰，多态性好的引物(图2)，即E-AAC/ M-CAA、E-AAC/ M-CAG、E-AAC/M-CTC、E-ACA/M-CAC、E-ACC/M-CAC、E-ACG/M-CAT、E-AGG/M-CAC和E-AGG/ M-CAG。8对引物扩增各得到条带142、140、174、174、174、146、164、130条，共计1244条，其中多态性条带1238条，多态性比率为99.6%。

图1基因组DNA电泳

图2 供试样品AFLP指纹图谱(E-AAC/M-CTC)

基于上述1244条条带计算样品两两之间的相似性系数(依照Nei和Li的方法)，得到相似性系数矩阵，聚类分析后获得树状分枝图(图3)。聚类结果表明，在相似系数0.77处，将15个大花序桉材料分为六组，第一组：组培苗DM1、种子苗1-2以及来自母树林的S14427；第二组：lhl002、来自母树林的S12196以及来自种源试验林的E111-4、E111-6、E632；第三组：1212和1224；第四组：只有来自母树林的B47；第五组：只有种子苗3；第六组：1203和1204。15份样品的相似性系数在0.74～0.84之间，1203与种子苗3亲缘关系最远，为0.74；1212与1224亲缘关系最近，为0.84。

图3 基于Nei和Li相似性系数得到的聚类分枝

4 讨论

(1)本试验中的多态性比率极高，蒙古栎[7]也有这种情况，较大可能包含假多态性条带。可能是引物筛选不理想，或者是样本受到污染，干扰了试验结果。此次试验读取的数据是大小在70～500 bp之间的清晰条带，实际产生的条带要比记录读取的多。70～500 bp读数范围能够较好的应用于八角、苹果[8]等树种的聚类，但可能不适用于大花序桉。通过查阅文献，发现相当一部分树种在更宽的范围内读取数值，比如：杉木[9]ISSR分子标记凝胶电泳读数范围在200～4000 bp；光皮桦[10]AFLP分子标记凝胶电泳读数范围在100～2000 bp；若扩展读数范围将会找到更多的特征谱带用于区分不同品种的大花序桉，更好地排除干扰因素，提高试验准确性。今后研究中在取样方法、DNA提取、标记方式选择等方面需要进一步验证。

(2)采自合山市柳花岭林场的Lhl002与来自母树林的S12196以及来自种源试验林的E111-4、E111-6、E632聚为一组，说明它们之间亲缘关系较近，可能来自同一种源。经咨询相关负责人，了解到Lhl002确实来自该种源试验林，从一方面验证了试验的准确性，说明利用分子标记弄清大花序桉亲缘关系是可行的。母树林的三个样本分别聚为三类，表明所建立的母树林遗传多样性丰富，为后续遗传改良提供了理想的遗传资源。

(3)进入21世纪以来，桉树作为速生丰产树种，在广西得到极大发展，但推广种植品种单一，多为尾叶桉与巨桉的杂交种中选育的无性系，且以纸浆材为主，实木利用少之又少。在限桉政策下，培育实木用途的大花序桉替代部分速丰桉林，不仅能够丰富造林树种种类，而且能够取得不错的经济效益。经过多年的引种，对大花序桉遗传多样性已有较深的认识，各地的种源引种试验均发现种源间存在显著的差异[11]，在种源内、家系内个体间亦存在丰富的变异[12]，说明大花序桉具有较高的遗传多样性。继续引入大花序桉种源，开展更为丰富的种源试验，利用分子标记技术辅助育种，尽快培育出更多的能够用于生产的良种资源是当务之急。