治愈乙型肝炎的全球战略

赵爽 谢青

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个全球性的公共卫生挑战。国际消除HBV联盟(ICE-HBV)是一个致力于加快开发治愈慢性乙型肝炎的专家联盟。未来乙型肝炎治愈的研究将集中于发现干预策略，这种策略将永久减少具有复制能力的受感染细胞的数量或永久沉默这些细胞中共价闭合环状脱氧核糖核酸，并将刺激HBV特异性宿主免疫反应，模拟HBV感染的自发缓解。还迫切需要建立标准化HBV试剂和方案，供全球所有HBV研究人员使用。

HBV是一个主要的全球公共卫生威胁，全球超过2.57亿人慢性感染；每年有超过88 7 000人死于HBV[1]。现有的治疗方法可以抑制病毒复制，但不能治愈，主要是由于病毒共价闭合的环状脱氧核糖核酸(cccDNA)转录模板在受感染肝细胞中的持续存在，以及慢性感染患者未能产生足够强的、功能性和持续的免疫反应来清除感染。因此，在大多数情况下，治疗必须终生维持。

ICE-HBV是一个国际性的、独立的、基于研究的论坛，成立于2016年，旨在加快HBV治愈的研究。该联盟提出了一个战略性和协作性的HBV研究议程，以推动发现一种安全、可支付、可推广和有效的慢性乙型肝炎治愈方法，并在可预见的未来人人都能获得。

一、慢性乙型肝炎与感染的缓解

急性和慢性乙型肝炎的自发缓解证明了HBV感染的免疫控制是可能的。然而，慢性感染或急性肝炎的临床缓解并不意味着病毒的完全根除，因为少量的cccDNA阳性肝细胞可以在这些个体中持续存在，并且可能是免疫抑制过程中病毒重新激活的来源[2]。如果要制定从受感染细胞中消除或控制其表达的策略，就迫切需要我们提高对HBV cccDNA的生物发生和同源状态的理解。

二、HBV治愈的定义

HBV治愈需要考虑治愈HBV感染和相关肝病，由此而变得复杂(图1)。最近美国肝病研究协会和欧洲肝病研究协会联合举办的HBV治疗终点研讨会进一步将完全治愈定义为血清中肝乙型肝炎表面抗原(HBsAg)检测不到，以及包括肝内cccDNA和整合HBV基因在内的HBV基因的根除[3]。功能性治愈被定义为血清中HBsAg和HBV DNA持续不可测(伴或不伴有抗-HBsb血清转换)以及肝内cccDNA和HBV基因整合量持续较低水平[3]。还提出了第三个定义：部分治愈，定义为在有限疗程结束后血清中可检测到HBsAg，但HBV DNA持续检测不到[3]。由于目前不可能从每一个被感染的细胞中根除HBV cccDNA微染色体库或整合的HBV DNA，但功能性治愈仍有可能实现，至少目前是这样。我们认为慢性HBV感染的治愈性治疗策略的理想目标应该是诱导与急性或慢性乙型肝炎缓解控制的那样得以缓解，只要这种方法是安全的。

图1乙型肝炎病毒复制周期(摘自： Revill PA, et al. Lancet Gastroenterol Hepatol,2019,4: 545-558)

由于学术界和企业界努力确定病毒靶点来研发药物，许多药物正在临床前模型中进行评估，或处于临床开发的第一阶段(图2)。这些包括干扰病毒进入的药物、靶向cccDNA或病毒核糖核酸的药物或其他方法、新型聚合酶或核糖核酸酶H抑制剂、核心蛋白变构调节剂和衣壳组装调节剂、干扰HBx功能的药物、靶向病毒和HBsAg出口的药物或影响病毒蛋白质组的试剂。其中一些化合物看起来很有希望显著降低HBV病毒载量或循环HBsAg，或两者都有显著降低，并促进抗-HBs的产生，但迄今为止似乎没有一种化合物能够治愈HBV感染。这些方法都不是直接针对HBV cccDNA库，但是将这些方法结合起来进行评估，以确定它们在cccDNA清除动力学中的有效性或它们改善抗病毒免疫应答恢复的能力将是很重要的。

图2 当前和未来治疗和治愈慢性乙型肝炎所需的HBV病毒学和免疫学靶标

乙型肝炎治愈的研究工作应集中于减少每个细胞的cccDNA分子数量和含cccDNA的细胞数量，并诱导HBV特异性免疫应答。为了实现HBV治愈的目标，ICE-HBV提出了两种策略，即在不杀死被感染细胞的情况下治愈HBV感染和诱导免疫控制以安全消除被感染细胞。这些方法中的每一种都需要有统一协调的临床研究来支持，以推进HBV治愈。下面详细描述了这些策略，以及推进HBV治愈所必需的临床方法。

三、乙型肝炎治愈的策略

(一)在不杀死被感染细胞的情况下治愈HBV感染 自从发现HBsAg以来，已经过去了50多年。2012年HBV入胞受体NTCP的发现彻底改变了我们体外研究从感染到出胞的HBV复制周期的能力，必须解决我们对HBV复制周期和宿主免疫反应的理解中的重要差距，从而利用复制周期中的漏洞来治愈感染。

靶向cccDNA微染色体库，消除cccDNA将是治愈慢性HBV感染最直接和有效的策略。目前的抗病毒药物不能消除cccDNA。细胞因子给药，包括α-干扰素，可以诱导APOBEC依赖的病毒脱氧核糖核酸脱氨作用，这一观察引起了关于这是否会导致受感染肝细胞中cccDNA显著减少的热烈讨论[4]。直接靶向cccDNA的方法 (如CRISPR/Cas9或其他基因编辑方法) 在实验室研究中已显示出有希望的结果，但包括肝细胞递送、非靶向效应,以及它们也切割染色体整合的HBV基因从而引发染色体重组的不可预测后果的可能性等问题需要仔细考虑。由于这些潜在的危险和困难，必须进一步探索针对病毒或宿主蛋白质的方法，这些蛋白质对cccDNA的形成、稳定性和表达(如HBx)至关重要。对cccDNA产生、维持和周转的基本生化、细胞和生理基础的研究势在必行，因为消除cccDNA是唯一有可能最终安全、持久地治愈HBV感染的策略。

由于在急性或慢性感染的自发或治疗诱导的缓解控制过程中没有完全根除cccDNA，因此在药理学上不可能完全根除cccDNA。在大部分cccDNA被消除后，剩余的cccDNA池的转录沉默或者抗体介导的病毒从剩余的受感染细胞传播的预防可能也是必要的。cccDNA表达的转录控制可以通过靶向HBx蛋白来实现，这对于cccDNA的表达或稳定性至关重要。因此，必须更深入地了解HBx、HBc和其他病毒蛋白在控制cccDNA同源状态中的作用。Smc5/6复合物是宿主限制因子，在缺乏HBx蛋白的情况下抑制cccDNA的表达[5]。最近发现，HBx通过劫持含有细胞DDB1的E3泛素连接酶以靶向Smc5/6复合体进行降解来促进cccDNA转录[5]。因此，针对HBx-DDB1结合相互作用的治疗方法也值得研究。转录后控制cccDNA或整合的HBV基因表达可以使用核糖核酸干扰来实现；目前正在努力实现这一目标，并取得了可喜的成果。还迫切需要开发原位、单细胞、单分子、活细胞分析，以可视化cccDNA的定位和运输，以及cccDNA依赖的替代报道细胞系统，用于高通量筛选cccDNA抑制剂。

(二)诱导免疫控制以安全消除HBV感染细胞 先天免疫应答和适应性免疫应答的复杂相互作用对病毒清除至关重要，这些应答的失败可能导致肝脏疾病。CD8+ T细胞是消除病毒的主要效应细胞，通过细胞溶解和非细胞溶解效应发挥功能。然而，保护性免疫需要足够的CD4细胞活性和中和抗HBV包膜抗体的产生。研究者已做出重大努力，将急性感染HBV清除的有效综合反应与慢性乙型肝炎患者观察到的免疫应答失调进行比较。这些知识已带来了第一代免疫疗法，第二代治疗性疫苗的开发也进入了I期和II期临床试验。

1．当前慢性HBV感染的免疫疗法

在动物模型和HBV感染患者中进行的研究已经确定了可以作为治疗目标的免疫调节的关键点。注射靶向Toll样受体或RIG-1的配体可抑制HBV小鼠模型中的病毒复制。这一观察结果导致了针对TLR-7[6]、TLR-8和RIG-1[7]的药物开发，以用于慢性HBV感染患者。大量实验表明，阻断抑制受体可以增强HBV特异性T细胞在体外和体内的扩增和功能。这推动了PD1/PDL1抗体在慢性HBV感染患者的I期研究中的应用。此外，IL-12似乎对恢复慢性感染中的T细胞扩增和功能至关重要。因此IL-12和诱导它的佐剂被纳入新一代慢性HBV治疗性疫苗。

2．HBV介导的T细胞耗竭和恢复机制

HBV持久性与CD8+ T细胞耗竭(在较小程度上)和病毒逃逸有关。持续暴露于高抗原负荷和肝细胞抗原呈递在CD8+ T细胞耗竭中起关键作用。抑制性受体(主要是PD-1)的表达、氨基酸(如精氨酸和色氨酸)的耗竭和线粒体的改变导致了T细胞功能障碍[8]。此外，CD4+ T细胞辅助活性、免疫抑制细胞因子、调节性T(Treg)细胞、粒细胞髓源性抑制细胞和自然杀伤细胞的缺乏也导致CD8+ T细胞衰竭[9]。然而，这些不同机制对T细胞衰竭的相对贡献还没有很好的描述，应该积极研究。此外，功能性T细胞修复是否可能，如果可能，HBV控制需要多少程度的T细胞修复，还没有完全了解。了解这些内容将可以完善我们恢复T细胞功能和改善免疫疗法的目标。另外，需要更好地理解抑制受体(如PD-1、CTLA-4、Tim-3)在疾病不同阶段的相对贡献，以确定最有可能受益于检查点阻断疗法的患者群体。

3．应重视疾病自然史中的B细胞

抗HBV抗体被用作解决HBV感染的生物标志物，但B细胞和抗体对慢性HBV感染的自然史和解决方案的影响，或对慢性HBV感染血清转换的影响尚未得到充分研究。B细胞可以产生免疫抑制性细胞因子IL-10，但它们的耗竭也可以导致已解决感染的患者和慢性乙型肝炎患者的临床再激活。因此，需要解决与B细胞生物学、抗体特异性和中和反应相关的基本问题，以便将B细胞更有效地纳入新的免疫治疗方法。

4．准确测量感染肝细胞的频率

慢性HBV感染免疫疗法的主要安全性问题是引发暴发性肝炎。因此，了解受感染肝细胞的实际数量、表达病毒抗原的肝细胞数量以及在个体患者中可被破坏而不会导致肝功能受损的肝细胞数量非常重要。在短期内，需要更好的方法来定量活组织检查或血清生物标志物中的感染肝细胞和整合肝细胞。能够在医学成像仪器上显示受感染肝脏的体内诊断将是一个理想的长期目标。

5．临床试验中免疫监测技术的标准化

临床试验期间免疫监测技术的标准化是一项巨大但必需的任务。为了提高不同位点之间免疫监测的一致性，我们建议开发集中管理和广泛可用的HBV肽库和四聚体。与此相结合的是ELISPOT和流式细胞术染色的有效方案。这种方法将有助于促进持续的T细胞监测。

6．免疫疗法的未来

目前在第一阶段试验中测试的检查点抑制剂恢复HBV特异性CD8+ T细胞功能的潜力为HBV免疫疗法提供了一个有希望的前景。然而，在未来的试验中，还需要解决一些重要的问题，如T细胞的修复程度、抗PD-1抗体的剂量、根据生物标志物或疾病阶段选择可能有反应的患者，以及修复后的T细胞造成组织损伤的不良反应风险。在这种情况下，同样重要的是确定联合治疗的疗效。例如，不同抗病毒治疗或治疗性疫苗接种的检查点抑制剂，这在临床前动物模型中已被证明是有效的[10]。针对先天免疫的治疗，用模式识别受体激动剂将抗病毒功效与炎症分开可以提高它们的治疗指数。除了完善免疫疗法，推进抗病毒免疫工程的策略也有希望。T细胞受体和嵌合抗原受体基因疗法规避了修复的需要[11]。然而，是否需要长期植入针对HBV的基因工程T细胞，以保持对从逃避清除的受感染细胞中传播的病毒的控制，还有待解决。这些都是在联合治疗的背景下，应考虑和研究的免疫治疗策略。基于互补作用机制合理配合使用抗病毒和免疫治疗药物，有望确保有效的抗病毒作用，消除感染肝细胞，提高HBV感染治愈率。

四、促进HBV感染治愈的综合临床研究

应建立一个已经获得恢复的HBV感染患者血清样本库，包括HBsAg清除患者和免疫控制(抗-HBs)患者，并在缓解前提供适当的匹配对照，供全球研究人员使用。研究者还迫切需要类似于艾滋病毒领域的HBV相关材料的集中储存库，使HBV研究人员能够方便地在全球范围内获取。

五、结论

现在是为全球受HBV影响的2.57亿人开发和实施一种安全、可支付、可广泛获得的慢性乙型肝炎治愈方法的时候了。针对cccDNA库并以安全和持久的方式刺激宿主免疫反应的新研究计划必须成为研究人员、基金会和政府的高度优先事项。应竭尽全力支持美国国立卫生研究院最近对HBV或艾滋病毒/HBV免疫学、病毒学和治疗学项目的R01呼吁。ICE-HBV力求通过促进与研究人员(HBV领域内外)、临床医生、制药行业和一系列利益攸关方(包括受慢性乙型肝炎影响的社区)的合作伙伴关系来实现其目标，在全球范围内努力发现、开发、测试和实施HBV治愈战略，以帮助确保WHO到2030年消除HBV作为公共健康威胁的目标得以实现。