鱼鳔类肝素的分离纯化与结构鉴定

周斯仪，钟赛意,2,3,*，苏伟明,3，杜振兴，陈建平，洪鹏志，章超桦,3,4

（1.广东海洋大学深圳研究院，广东 深圳 518108；2.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088；3.广东省水产品加工与安全重点实验室，广东 湛江 524088；4.广东省海洋生物制品工程实验室，广东 湛江 524088）

鱼鳔也称鱼泡、鱼肚或鱼胶等，是鱼类调节沉浮的器官。鱼鳔富含胶原蛋白、多糖等活性物质，自北魏《齐民要术》开始记载以来，一直被视为药食两用的滋补珍品。《本草纲目》记载鱼鳔有止血作用，可用来治疗吐血、崩漏、外伤出血和产后抽搐等[1]。《本草新编》称鱼鳔具有养肝益肾、补肾固精的功效[2]。鱼鳔还能滋养经脉、散瘀消肿[3]。但其作用功效和物质基础仍不明确。目前对鱼鳔功能因子研究主要集中在其胶原蛋白和多肽的提取、结构表征及生物活性等方面[4-6]。近几年有报道发现鱼鳔多糖具有预防结肠癌、缓解胃溃疡、系统性红斑狼疮炎症的潜力[7-9]，但目前对鱼鳔多糖的组成和结构特性尚未明确。本课题组前期研究发现鱼鳔多糖以糖胺聚糖为主[10]，并进一步发现其主要由类肝素化合物组成。

肝素是由糖醛酸与葡萄糖胺组成的聚阴离子黏多糖，作为高效的抗凝血药物广泛应用于临床治疗。随着药理学的发展，发现肝素还具有抗血栓、抑制平滑肌细胞增生、抗炎症和抗肿瘤等生物活性，但其较高的抗凝血作用容易引起出血副作用，因而限制了其在非抗凝方面的应用[11]。类肝素是结构上与肝素结构相似的一类酸性黏多糖，常见的有硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）、硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）和硫酸皮肤素（dermatan sulfate，DS）等。类肝素抗凝血作用相对较低，长期使用无肝素抗凝血活性引起的副作用。因此类肝素化合物越来越多地引起研究者关注。本研究采用酶法提取鱼鳔类肝素（heparinoid from swimming bladder，HSB），并对其进行分离纯化和结构鉴定，以期为阐明鱼鳔多糖的结构组成和构效关系提供参考，为鱼鳔功效因子的进一步开发与利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鱼鳔（鲈鱼，Lateolabrax japonicus）购自湛江市霞山水产品批发市场；2709碱性蛋白酶（1.2×105U/g）南宁庞博生物工程有限公司；FPA98 Cl型大孔阴离子交换树脂 罗门哈斯（中国）公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（5-methyl-2-phenyl-2,4-dihydro-3H-pyrazol-3-one，PMP）、CS二糖标准品（ΔDi-0S、ΔDi-UA-2S、ΔDi-4S和ΔDi-6S） 美国Sigma公司；乙腈（色谱纯）德国Meker公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

N-1300D-WB型旋转蒸发仪 东京理化器械株式会社；HR/T20MM型高速冷冻离心机 湖南赫西仪器装备有限公司；FD8508型真空冷冻干燥机 韩国ilShin公司；Xevo G2-XS QTof高分辨质谱（mass spectrometry，MS）仪 美国Waters公司；Agilent1200高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）系统 美国安捷伦公司；Bruker AV-500和AV-700超导核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）仪 德国Bruker BioSpin GmbH公司。

1.3 方法

1.3.1 HSB的制备与分离

参考文献[11]中肝素的制备工艺并略作调整，工艺流程为：鱼鳔干粉→酶解→灭酶→离心取上清液→大孔阴离子交换树脂吸附洗脱→醇沉→离心收集沉淀→无水乙醇洗涤2 次→透析→冷冻干燥。

具体步骤：鱼鳔经烘干、粉碎后，加入20 倍体积的双蒸水和质量浓度为5.4 mg/mL的蛋白酶，50 ℃水浴锅中酶解20 h；沸水浴灭酶10 min，冷却后离心（8 000 r/min、20 min）；取上清液用大孔阴离子交换树脂进行动态吸附，再分别用0.3、0.5、0.9、1.1 mol/L氯化钠溶液进行梯度洗脱；每分钟收集一管，用阿利新蓝法分析管中类肝素含量，以收集管数为横坐标、阿利新蓝法染色所得吸光度（A490nm）为纵坐标制作梯度洗脱曲线；收集洗脱液，缓慢加入1 倍体积的无水乙醇，静置12 h后离心（4 000 r/min、5 min），收集沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤2 次；经3 kDa透析袋脱盐，冷冻干燥。

1.3.2 基本成分质量分数和HSB得率的测定

类肝素质量分数测定采用阿利新蓝法[12]，以肝素为标准品；蛋白质量分数测定采用福林-酚法[13]，以牛血清白蛋白为标准品；糖醛酸质量分数测定采用咔唑-硫酸法[14]，以葡萄糖醛酸为标准品；氨基己糖质量分数测定采用改进的Wagner法[15]，以葡萄糖胺为标准品；硫酸基质量分数测定采用BaCl2-gel比浊法[16]，以硫酸钾为标准品。HSB得率和各成分质量分数分别按式（1）、（2）计算。

式中：md1为HSB质量/mg；md2为鱼鳔干粉质量/g。

式中：ρ为某成分质量浓度/（mg/mL）；md3为所称取HSB质量/mg；V为溶液体积/mL。

1.3.3 HSB的种类鉴定

类肝素化合物的结构鉴定采用醋酸纤维素薄膜电泳法，具体步骤参考文献[17]。

1.3.4 HSB的纯度分析

HSB用蒸馏水配成1 mg/mL的溶液，以蒸馏水为调零管，采用紫外-可见分光光度计测定样品的紫外吸收光谱。

1.3.5 HSB的分子质量分析

采用高效凝胶色谱（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）测定HSB的分子质量[18]。色谱柱：Ultrahydrogel Column 500糖分析凝胶柱（7.8 mm×300 mm，10 μm）；柱温：35 ℃；流动相：0.2 mol/L硫酸钠；流速：0.6 mL/min；检测器为1200示差检测器；进样体积：10 μL。

葡聚糖标准品（分子质量分别为10 000、23 800、48 600、80 000、150 000、273 000、409 800 u）和HSB分别用0.2 mol/L硫酸钠溶液配制成质量浓度为5 mg/mL的溶液，经0.22 μm的针式滤膜过滤后进样。记录标准品和样品的保留时间并进行数据处理。

1.3.6 HSB的单糖组成分析

样品前处理：称取样品3.0 mg于15 mL样品瓶中，加入1.5 mol/L的三氟乙酸9 mL，置于110 ℃烘箱中分别水解2、4、6、8、12、16、24、28 h，水解液用氮气吹干，蒸干物用超纯水溶解，并于－20 ℃下保存备用。

处理后的样品和单糖标准品采用PMP衍生-高效液相反相色谱法测定[19]。单糖标准品：甘露糖（mannose，Man）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）、艾杜糖醛酸（iduronic acid，IdoA）、N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）、半乳糖（galactose，Gal）。色谱柱：ZORBAX EclipseXDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：0.02 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0）-乙腈溶液（83∶17，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：245 nm；进样体积：10 μL。

1.3.7 HSB结构的FTIR分析

取2.0 mg样品，在红外灯下烘烤2 h，然后放入玛瑙研鉢中，加入100 倍质量的以同样方式处理的氯化钾，混合均匀，研磨至颗粒小于2.5 μm，放入压片机中加压制成半透明的小薄片；再将其放入傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrophotometer，FTIR）扫描仪中进行光谱扫描，扫描范围为4 000～400 cm－1。

1.3.8 HSB的二糖组成分析

二糖组成分析参考文献[20]的方法并稍作修改。精密称取0.010 0 g多糖样品，加入5 mL醋酸铵缓冲液（pH 7.6～8.0，含0.2 U CS酶ABC），37 ℃孵育24 h。沸水浴灭酶5 min，10 000 r/min离心25 min。上清液用3 kDa超滤离心管过滤，取滤液冷冻干燥。将处理后的样品和CS二糖标准品（ΔDi-0S、ΔDi-UA-2S、ΔDi-4S和ΔDi-6S）分别用超纯水配成1 μg/mL溶液用于MS/MS分析。

MS条件：电子轰击离子源；电子能量70 eV；传输线温度275 ℃；离子源温度200 ℃；母离子m/z 285；激活电压1.5 V；质量扫描范围m/z 35～500。

1.3.9 HSB结构的NMR分析

HSB样品溶于D2O中，冷冻干燥，反复3 次以置换出H2O。处理后的样品用D2O配制成30 mg/mL的溶液，在常温下用NMR仪进行1H谱、13C谱、异核单量子相干（heteronuclear singleqauntum coherence，HSQC）谱和异核多键相关（heteronuclear multiple-bond correlation，HMBC）谱分析。

1.4 数据分析

所有实验重复3 次，结果以平均值±标准偏差表示，采用Origin 9.1和ChemBioDraw Ultra软件作图。

2 结果与分析

2.1 HSB的分离结果

图1 类肝素化合物FPA98 Cl型大孔阴离子交换柱洗脱曲线Fig. 1 Elution curve of heparinoids on FPA98 Cl column

类肝素为聚阴离子酸性黏多糖，在组织中以糖蛋白的形式存在。因此，类肝素的提取以酶法为主，蛋白酶将糖蛋白中的蛋白质分解成易于去除的小肽和氨基酸，使类肝素从中释放出来。游离在酶解液中的类肝素经FPA98 Cl型大孔阴离子交换树脂动态吸附，再用氯化钠溶液梯度洗脱，使中性多糖、蛋白质和多肽等杂质被低浓度的氯化钠溶液洗脱下来，带阴离子基团较多的类肝素则被高浓度氯化钠溶液洗脱下来。梯度洗脱结果图1所示，0.3、0.5、0.9、1.1 mol/L氯化钠溶液分离出的洗脱液经醇沉、透析、冷冻干燥后，得到4 个组分：F1、F2、F3和F4。各洗脱组分的得率和基本成分质量分数见表1。

表1 各洗脱组分的HSB得率与基本成分Table 1 Yield and composition of each elution fraction

由表1可知，从组分F1到F4，类肝素、糖醛酸和氨基己糖质量分数逐渐升高，蛋白质量分数递减，说明该方法能将类肝素高效分离出来。组分F4的HSB得率最高，为（2.21±0.03）mg/g，F2次之；组分F1蛋白质质量分数最高，HSB得率和类肝素质量分数都很低，且检测不到糖醛酸和氨基己糖，说明组分F1可能为中性糖和蛋白质的混合物，梯度洗脱曲线中该组分吸光度高可能受色素、蛋白质等杂质的影响。组分F4的硫酸基质量分数最高，为（12.29±2.20）%，F3次之，其他组分未检测到硫酸基。硫酸基质量分数是提示类肝素活性的一项重要指标，一定范围内硫酸基的质量分数越高，生物活性越强[21]。Sayari等[17]用海鳌虾壳提取的类肝素中硫酸基质量分数高达（23.00±0.03）%，具有较强的抗凝血和抗细胞增殖作用。

2.2 HSB的种类鉴定结果

图2 各洗脱组分及标准品的醋酸纤维素薄膜电泳结果Fig. 2 Acetate cellulose electrophoresis of each elution fraction and glycosaminoglycan standard

不同种类的糖胺聚糖之间存在电荷密度差异，在醋酸纤维素薄膜电泳中表现出不同的迁移率。各洗脱组分醋酸纤维素薄膜电泳结果如图2a所示，组分F1为单一条带，迁移率最低，这与其基本成分分析相符，进一步验证F1可能是中性糖；组分F2和F3有4 个条带，说明所含糖胺聚糖种类较多；组分F4为单一条带，迁移率最大。结合各组分HSB得率和理化性质分析，选择类肝素、糖醛酸、氨基己糖和硫酸基质量分数最高、蛋白质量分数低、醋酸纤维素薄膜电泳条带单一的组分F4做进一步结构鉴定。

醋酸纤维素薄膜电泳操作简易、灵敏度高，可作为初步鉴别糖胺聚糖种类的方法。在吡啶-甲酸缓冲液（pH 3.0）中，相对迁移率从小到大依次为透明质酸、硫酸角质素、DS、CS和肝素[20]。由图2b可知，肝素因电荷密度最高，迁移率最大；其次分别是CS、DS。组分F4的条带与CS迁移率相近，初步确认组分F4为CS。

2.3 组分F4的纯度及分子质量

2.3.1 紫外光谱扫描结果

图3 组分F4紫外光谱图Fig. 3 Ultraviolet absorption spectrum of F4

紫外光谱扫描是评价类肝素纯度的方法之一。类肝素在185～220 nm处有糖基末端的吸收峰[8]，核酸和蛋白质分别在260、280 nm处有特征吸收峰。由图3可知，紫外光谱扫描结果显示，组分F4除在204 nm处有糖基末端吸收峰外，在其他紫外区域无明显吸收峰；结合2.1节组分F4的蛋白质量分数为（0.19±0.07）%，表明F4纯度较高。

2.3.2 HPGPC分析结果

图4 组分F4的HPGPC图谱Fig. 4 High performance gel permeation chromatogram of F4

由图4可知，组分F4的HPGPC图只出现1 个峰，且峰形较对称，表明F4的质量分布相对均一，纯度较高。高效凝胶色谱与示差折光检测器联用测得葡聚糖的分子质量的对数（y）与保留时间（x）的回归方程为：y＝－0.319 2x＋9.429 0（R2＝0.996 6），计算得出组分F4的分子质量约为84 000 u。一般类肝素的分子质量在5 000～40 000 u范围之间[22]，相比之下，组分F4的分子质量较大。

2.4 组分F4的单糖组成分析结果

糖胺聚糖由特定的重复二糖单位构成，根据二糖组成的差异，分为透明质酸、HS、肝素、DS和CS。因此，可以根据单糖组成推测类肝素黏多糖的种类。对比单糖混标的HPLC图谱（图5）发现，组分F4单糖衍生物（水解时间8 h）的HPLC图（图6）中出现1 个峰值很高的未知峰。由图7可知，随着组分F4水解时间的延长，未知峰的峰面积比例减少，GlcA和IdoA的峰面积比例也逐渐减少，GalNAc的峰面积比例不断升高，说明未知峰可能是未降解的寡糖片段。另外，也有报道称此处为未降解完全的寡糖片段[23]。这可能是由于半乳糖胺较难水解，有研究表明半乳糖胺比其他单糖需要更长的时间才能完全被降解[19,24]。糖醛酸在酸溶液中不稳定，易发生脱羧反应，甚至会被强酸完全分解[25]，因此随降解时间的延长糖醛酸的峰面积比例降低。根据保留时间和峰面积比例得出，组分F4主要含GlcA、GalNAc和少量的IdoA、Gal，由此得出其主链可能是CS。

图5 混合标准品单糖衍生物的HPLC图谱Fig. 5 High performance liquid chromatogram of mixture of monosaccharide derivative standards

图6 组分F4单糖衍生物的HPLC图谱Fig. 6 High performance liquid chromatogram of monosaccharide derivatives from F4

图7 水解时间对组分F4降解产物峰面积比例的影响Fig. 7 Effect of hydrolysis time on percentage peak areas of degradation products from F4

2.5 组分F4结构的FTIR分析结果

图8 组分F4和CS的FTIR图Fig. 8 Fourier transform infrared spectra of both F4 and CS

由图8可知，组分F4的FTIR图与CS标准品基本一致。3 421 cm－1处出现强而宽的峰是O—H和N—H伸缩振动，说明组分F4存在分子间和分子内的氢键[26]；2 918 cm－1处的吸收峰表明存在亚甲基[27]；1 646 cm－1处强而稍宽的峰是乙酰氨基中的C＝O对称伸缩振动产生的，另外，1 557 cm－1处N—H变角振动峰和1 419 cm－1处C—N伸缩振动峰表明存在乙酰氨基[28-29]；1 377 cm－1处的峰是—COO－中的C＝O对称伸缩振动产生的[27]；1 234 cm－1处不太尖锐的峰可能是C—H变角振动；1 255 cm－1处硫酸基中的S＝O伸缩振动和852 cm－1处硫酸酯基中的C—O—S轴向伸缩振动表明存在硫酸基团[35]；927 cm－1处的吸收峰是吡喃糖环的非对称伸缩振动产生的[30]。

根据二糖单位中硫酸基数量和链接位置的不同，CS分为A、C、D、E等种类。A型CS（CSA）的硫酸基在C4位，产生的轴向伸缩振动峰在850 cm－1附近；C型CS（CSC）的硫酸基在C6位，硫酸基处于平位，吸收峰在820 cm－1附近[31]。本实验所用CS标准品为E型CS（CSE），在820 cm－1和850 cm－1附近均有吸收峰。组分F4只在850 cm－1附近有吸收峰，表明F4可能为CSA或其衍生物。

2.6 组分F4的二糖组成分析结果

根据以上结果得出组分F4中主要含CS。为进一步分析组分F4的二糖组成，采用CS酶ABC将CS完全裂解成不饱和二糖，再经MS/MS分析鉴定。根据硫酸基团数量及链接位置，CS二糖分为ΔDi-0S、ΔDi-UA-2S、ΔDi-4S和ΔDi-6S等。其中，ΔDi-4S是CSA的主要二糖单位，ΔDi-6S是CSC的主要二糖单位。此外，由于具有相同硫酸基团数量的二糖相对分子质量相同，不能通过准离子峰区分开，因此通过二级质谱的碎片离子进行区分。组分F4完全降解产物和4 种常见的CS二糖标准品的MS/MS结果如图9所示。

图9 组分F4裂解产物和二糖标准品的MS/MS图Fig. 9 MS/MS spectra of degraded products of F4 and disaccharide standards

图10 CS二糖碎片基本组成图[32-33]Fig. 10 Basic composition of chondroitin sulfate disaccharide fragments[32-33]

图10 为CS二糖碎片的基本组成[32-33]。结合图10和表2可知，ΔDi-0S和ΔDi-UA-2S的半乳糖胺不含硫酸基，特征碎片结构是[Z1－2H]－，m/z为202.09；ΔDi-UA-2S的硫酸基连接在葡萄糖醛酸C2的羟基上，因此具有[Y2－H]－和[Z2＋Na－H]－特征碎片结构，其m/z分别为236.99、276.98。ΔDi-4S和ΔDi-6S的区别体现在，ΔDi-4S在m/z282处的离子相对丰度小于m/z300或不存在，而ΔDi-6S在m/z300处的离子相对丰度小于m/z282或不存在[34]。图9中ΔDi-4S在m/z300.06处的离子相对丰度大于m/z282.05，ΔDi-6S在m/z282.05处的离子相对丰度较大，在m/z300.06处没有碎片峰。此外，还观察到ΔDi-6S在m/z239.94处的特征峰，其结构为[W1－H]－，可用来判断是否存在ΔDi-6S。组分F4完全降解产物的质谱图中，在m/z202.09、236.99、276.98处没有碎片峰，表明组分F4不含ΔDi-0S和ΔDi-UA-2S；在m/z300.06处的离子相对丰度大于m/z282.05，且不含ΔDi-6S特征峰m/z239.94，说明F4的主要二糖单位为ΔDi-4S。结合FTIR扫描结果，确定组分F4主要为CSA。

表2 二糖MS/MS特征碎片峰及其结构Table 2 MS/MS characteristic fragment peaks of disaccharides and their structures of disaccharides

2.7 组分F4结构的NMR鉴定结果

图11为组分F4的1H、13C、HSQC和HMBC的NMR谱图。在1H NMR谱图中，质子信号最强的峰位于δ4.79处，是氘代水产生的溶剂峰，除此之外，所有质子信号均位于2 个光谱区。在δ2.0～2.1之间出现了乙酰胺甲基信号，文献[35]报道CSA和CSC的乙酰胺甲基信号分别在δ2.04、2.02处，组分F4乙酰胺甲基信号位于δ2.04，说明F4可能为CSA；其他质子信号集中在δ3～5之间，说明F4为β-构型[36]。

图11 组分F4的NMR 图谱Fig. 11 NMR spectraof F4

在13C NMR谱图中，δ174.96和δ174.35的低场信号表明存在乙酰氨基和己糖醛酸的羧基；δ22.45的高场信号可能为乙酰胺甲基碳；其他信号集中在δ50～105之间。此外，由HSQC谱图中的（2.04，22.47）和HMBC谱图（2.04，174.38）确定δ22.47为乙酰氨基的甲基碳信号，δ2.04为乙酰氨基的甲基质子信号，δ174.38为乙酰氨基的羰基碳信号。参照文献[35]和[37]对组分F4的1H、13C NMR谱进行归属，结果如表3所示。对1H、13C、HSQC和HMBC图谱进行综合分析，得出组分F4主要结构式为[→4GlcUA β1→3GalNAc(4S)β1→]n。

表3 组分F4的1、13C NMR信号归属Table 3 1E and 13C nuclear magnetic resonance signal assignment of F4

表3 组分F4的1、13C NMR信号归属Table 3 1E and 13C nuclear magnetic resonance signal assignment of F4

信号归属 1 2 3 4 C-5 6 NAc-1 NAc-2 GlcA-H 4.47 3.38 3.59 3.79 3.67 GlcA-C 103.39 72.07 73.34 80.19 76.27 174.96 GalNAc-H 4.57 4.03 4.02 4.75 3.84 3.79 2.04 GalNAc-C 100.65 51.25 75.35 76.23 74.23 60.73 174.38 22.47

3 结 论

本研究以鱼鳔为原料，采用酶法提取类肝素，通过阴离子交换树脂和醇沉进行分离纯化，制备出得率较高、结构相对均一的类肝素组分F4，其得率为（2.21±0.03）mg/g，类肝素质量分数为（85.79±0.63）%。紫外光谱和HPGPC结果表明组分F4纯度较高；分子质量分布相对集中，约为84 000 u。通过柱前衍生-HPLC得出组分F4主要含GlcA、GalNAc和少量的IdoA、Gal。组分F4的FTIR谱图和二糖组成与CSA一致，结合NMR分析得出组分F4主要结构式为[→4GlcUA β1→3GalNAc(4S)β1→]n，属于CSA。CSA具有免疫调节[38]、抗炎[39]、抗氧化[40]和抗肿瘤[41]等活性，主要用于预防骨关节炎、冠心病、神经痛及角膜炎等疾病[11]。本研究可为进一步分析鱼鳔功能及其作用机理、提高鱼鳔的利用价值提供参考。