大豆异黄酮和牛初乳复合制剂对去卵巢大鼠骨质疏松症的改善及抗氧化作用
2019-08-28陈蓓旖马丽娜牛诗捷毛宇航程光宇
郁 桦,常 萍,陈蓓旖,韦 蓉,马丽娜,牛诗捷,甘 露,毛宇航,程光宇,4,*
(1.江苏天美健大自然生物工程有限公司,江苏南京 210046;2.南京师范大学中北学院,江苏南京 210046;3.南京师范大学泰州学院,江苏泰州 225300;4.南京师范大学生命科学学院,江苏南京 210023)
骨质疏松症是目前全球发病率、致残率及医疗费用较高的疾患之一,是以骨量减少、骨质量受损及骨强度降低,导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病,被世界卫生组织列为三大老年疾病之一。随着我国进入老龄社会,骨质疏松症的发病率持续增高,全国大约有0.9亿骨质疏松症患者[1],其中绝经后妇女骨质疏松的概率约为80%[2]。目前,对于骨质疏松症的防治多采用抗骨质吸收药物,如钙剂、降钙素、雌激素等和促进骨形成药物,如甲状旁腺激素、类固醇等化学药物进行联合防治[3]。但有些药物价格高,作用单一,有毒副作用,长期服用会对身体产生不利影响。近几年,一些中药及其复方制剂能促进骨形成,提高骨密度,在治疗骨质疏松症方面显示了显著疗效[4]。我国动植物药资源丰富,从中筛选出安全、高效的预防骨质疏松症的天然制剂,是一种理想的防治方法。
大豆异黄酮是来自大豆的天然成分,具有雌激素样作用,能有效预防妇女更年期的骨质疏松症,同时也是良好的抗氧化物质。牛初乳冻干粉是奶牛分娩后7 d以内乳汁的冻干制剂,不仅含有丰富的人体必需营养物质,还含有免疫球蛋白、生长因子等多种生物活性物质。研究表明牛初乳冻干粉具有抗氧化和自由基清除作用[5],能促进胎鼠骨骼发育和成骨细胞增殖[6]。来源牛奶的一种抗氧化肽能预防氧化应激所致的成骨细胞功能紊乱[7]。超细鲜骨粉是优良的补钙剂,生物吸收利用率高达60%~90%,其制剂对大鼠骨质疏松有改善作用[8]。最近的研究显示,大豆异黄酮和牛初乳冻干粉在体内、外的实验中具有较好的抗氧化特性[5,9]。利用大豆异黄酮、牛初乳冻干粉和超细鲜骨粉制备成复合制剂,已经初步显示了能增加去卵巢大鼠的骨密度,对子宫有较好的抗氧化作用[10]。
研究表明,氧化应激是绝经后骨质疏松症的重要发病机制[11],抗氧化剂能通过激活成骨细胞分化,抑制破骨细胞活性和骨细胞凋亡,诱导骨形成,预防去卵巢大鼠的骨质丢失[12]。因此,可通过使用有抗氧化活性的物质来提高机体抗氧化能力,达到防治骨质疏松的目的。抗氧化酶在机体的抗氧化系统中发挥着极其重要的作用,其在血浆和组织中的水平能反映机体氧化应激状态和抗氧化能力,为骨质疏松的防治提供依据。但目前报道的主要是骨质疏松患者或动物血浆(液)的抗氧化能力,对其主要组织的抗氧化作用研究较少。
本文以大豆异黄酮、牛初乳冻干粉和超细鲜骨粉为原料制成复合制剂,通过测定活性氧清除作用,利用建立去卵巢动物模型模拟绝经后女性的骨质疏松,测定骨密度、矿质元素和血液、肝、肾、脾组织的抗氧化作用,进一步探讨复合制剂对去卵巢大鼠骨质疏松症的改善和抗氧化作用,旨在为具有增加骨密度功能的保健食品的开发利用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
大豆异黄酮和牛初乳复合制剂[简称复合制剂(SIBC)]组成成分为大豆异黄酮、牛初乳冻干粉和超细鲜骨粉,含量分析表明,SIBC中主要功能成分含量大豆苷为2.98%,大豆苷元为0.74%,染料木素为0.09%,染料木苷为0.7%,免疫球蛋白G为14.2%,蛋白质为31.0%,钙为9.25%。SIBC人体推荐摄入量为1.4 g/人/d,即23.3 mg/kg BW/d,该样品不以补钙为主;实验动物 健康雌性SD大鼠60只,清洁级,体重300 g左右,中国科学院上海实验动物中心;饲料 参照AIN93饲料配方[13],配制成半成品饲料,用适当的物质替换饲料中来源于大豆的成分,以避免大豆异黄酮的植物雌激素样作用对实验的影响(饲料的成分和含量如下:酪蛋白:23.0%;DL-蛋氨酸:0.3%;玉米淀粉:32.0%;蔗糖:30.0%;纤维素:5.0%;玉米油:5.0%;混合矿物盐:3.5%;混合维生素:1.0%;二酒石酸胆碱:0.2%);四乙氧基丙烷、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250 美国Sigma公司;氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、水杨酸、硫代巴比妥酸、硝酸和高氯酸(优级纯) 国药集团化学试剂有限公司;其他试剂 为国产分析纯或生化试剂;AKP(碱性磷酸酶)试剂盒 南京建成生物工程研究所。
HG9620A型原子吸收分光光度计 沈阳华光精密仪器有限公司;LUNAR EXPEERT #1117型双能X线骨密度仪 美国LUNAR公司;Z36HK 型高速冷冻离心机 德国Hermle 公司;EV300型紫外可见分光光度计 美国Thermo fisher公司。
1.2 实验方法
1.2.1 活性氧(ROS)清除作用的测定 取SIBC分别加入50 mmol/L的pH7.4和pH7.8的磷酸盐缓冲液(PBS)及生理盐水,混匀,超声处理20 min,于8000×g冷冻离心10 min,取上清液配成一定浓度的系列样品提取液,以VC为阳性对照,按以下方法测定其ROS清除作用:
H2O2清除率(%)=(A0-A1+A2)/A0×100
1.2.2 大鼠骨质疏松模型的建立 按文献[13]建立大鼠骨质疏松模型如下:大鼠经用30 mg/kg BW戊巴比妥钠溶液麻醉后仰卧位固定,距剑突下约3 cm处剪毛,碘伏消毒,正中切开皮肤和腹肌,找到子宫,结扎输卵管后依次切除双侧卵巢,分层缝合切口,最后经肌肉注射2万U青霉素预防感染。大鼠去卵巢后逐只进行阴道涂片(1次/d),连续7 d,检查去卵巢是否完全。取去卵巢手术的成功大鼠用于实验。假手术组按同法进行手术,但仅切除一小块脂肪,不切除卵巢。大鼠卵巢切除后恢复一周,进行分组和处理。实验分为假手术组(对照组)、去卵巢组(模型组)、去卵巢加低剂量组(117 mg/kg,低剂量组)、去卵巢加中剂量组(233 mg/kg,中剂量组)和去卵巢加高剂量组(467 mg/kg,高剂量组),每组10只动物。实验样品用双蒸水配制,每天经口灌胃给予(对照组和模型组给予与样品体积相等的双蒸水),连续灌胃90 d。实验期间所有动物均饲喂配制饲料,自由摄食饮水,并定期测量体重。试验结束时,尾部采血,4 ℃冰箱放置过夜,2500×g离心5 min,收集血清备用。处死动物后取其股骨,并分离组织分别进行骨骼和生化指标分析。
1.2.3 骨密度测定 动物处死后分离出左侧股骨,用生理盐水浸泡的纱布包裹,用双能X线骨密度仪测定左侧股骨中点和股骨远心端骨密度。
1.2.4 骨和血清中矿物元素含量的测定 取大鼠右侧股骨,剔去肌肉等软组织后于105 ℃干燥至恒重,用分析天平称量骨干重,用游标卡尺测量骨长度。样品中骨Ca含量测定采用混合酸(硝酸∶高氯酸=4∶1)消化法,按GB/T 5009.92-2003原子吸收分光光度法进行。血清磷含量测定采用磷钼蓝比色法,参考张龙翔等[17]方法。血清Ca、Zn含量测定同样采用混合酸消化法,分别按GB/T 5009.92-2003和GB/T 5009.14-2003进行。
1.2.5 AKP 活性测定 血清AKP 活性测定按试剂盒说明书进行,结果以U/100 mL表示。
1.2.6 SOD活性测定 采用Stewert等[18]方法测定SOD活性。血液SOD测定时,取20 μL血液于1 mL含肝素的生理盐水中混匀,3000×g离心5 min,弃上清液,保留沉淀的红细胞,加蒸馏水0.2 mL 充分溶血,加入95%乙醇0.1 mL,振荡30 s,加入三氯甲烷0.1 mL,再振荡30 s,6000×g离心5 min,上清液用于SOD活性测定。组织SOD测定时,取组织剪碎后加入预冷50 mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.8),于冰浴中进行超声波破碎(400 W,20 s×2),制备成10%匀浆,12000×g离心10 min,取上清液测定SOD活性。
1.2.7 MDA含量测定 取血和组织用0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)分别制备10%溶血液和10%组织匀浆,2000×g离心10 min,取上清液用TBA比色法[13],以四乙氧基丙烷为标准测定MDA含量。
1.2.8 血脂含量测定 血清总脂、总胆固醇(TC)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测定分别按崔福生的香草醛微量法、邻苯二甲醛测定法和邻苯二甲醛显色法[19]进行。
1.2.9 蛋白质含量测定 蛋白质含量测定采用Breadford法[20],以牛血清白蛋白为标准蛋白。
1.3 统计学分析
2 结果与分析
2.1 SIBC对ROS清除作用的影响
图1 SIBC的和H2O2(C)的清除活性
2.2 SIBC对去卵巢大鼠体重的影响
实验期间,各组大鼠体重随时间逐渐增加(表1),在实验第30、60、90 d时,各去卵巢大鼠组体重显著高于对照组(p<0.05);各去卵巢大鼠组在给予实验样品后,组间动物体重差异无显著性。实验结果说明SIBC对去卵巢大鼠体重的变化无显著影响。
表1 SIBC对去卵巢大鼠体重的影响Table 1 Effects of SIBC on body weight of OVX
2.3 SIBC对去卵巢大鼠股骨Ca含量和骨密度的影响
造模后的模型组骨Ca含量和骨密度显著低于对照组(p<0.05),表明去卵巢大鼠的骨质疏松模型成立。在给予SIBC后,低、中、高剂量组骨Ca含量分别比模型组提高4.4%、10.3%、11.6%,且中、高剂量组骨Ca含量与模型组相比有显著性差异(p<0.05)。去卵巢大鼠的股骨中点及远心端骨密度分别比对照组分别下降12.1%和16.6%,给予中、高剂量SIBC后,股骨中点及远心端骨密度分别比模型组提高10.0%、10.9%和9.1%、9.4%,均有显著性差异(p<0.05)。各组大鼠的骨干重和骨长测定无显著性差异(见表2)。骨密度是评价骨质疏松的直接指标,骨密度降低反映了骨Ca量丢失,以上结果表明,SIBC对去卵巢大鼠的骨Ca丢失和骨密度降低有较好缓解作用。
表2 SIBC对去卵巢大鼠股骨Ca含量和骨密度的影响Table 2 Effects of SIBC on femur calcium content and bone density of OVX
2.4 SIBC对去卵巢大鼠血清矿质元素含量和AKP活力的影响
表3结果显示,模型组血清Ca、Zn含量与对照组相比显著下降(p<0.05),在给予SIBC后,与模型组相比,低剂量组血清Ca含量显著增加(p<0.05),中剂量组血清Ca含量极显著增加(p<0.01);中、高剂量组血清Zn含量均显著增加(p<0.05)。造模后的模型组AKP活力极显著高于对照组(p<0.01),在给予低、中、高剂量SIBC后,其AKP活力分别比模型组下降了34.2%、49.2%、35.7%,且与模型组相比,差异均有显著性(p<0.05或p<0.01)。P含量在造模后低于对照组,但无显著性差异,在给予SIBC后与模型组相比,未观察到显著性提高。可见,SIBC对去卵巢大鼠血清矿质元素的增加和AKP活力降低有一定的改善作用。
表3 SIBC对去卵巢大鼠血清Ca、Zn、P含量及AKP活力的影响Table 3 Effects of SIBC on content of serum Ca,Zn,P and AKP activity of OVX
2.5 SIBC对去卵巢大鼠SOD活性的影响
大鼠血液和组织SOD活性测定见表4。造模后模型组大鼠血液、肝、肾SOD活性与对照组相比显著降低(p<0.05或p<0.01),提示大鼠去卵巢后抗氧化酶活性下降,自由基代谢平衡失调。当给予低、中、高剂量SIBC后,随剂量的增加,SOD活性提高,且具有明显的剂量依赖性,与模型组相比,中剂量组血液、肾SOD活性和高剂量组脾SOD活性分别提高了17.3%、8.0%和24.4%,差异显著(p<0.05);高剂量组血液、肝、肾SOD活性分别提高了19.3%、12.5%和15.7%,差异极显著(p<0.01)。说明SIBC能通过提高血液和主要组织的抗氧化酶活性,有效清除自由基,降低氧化应激反应,缓解去卵巢大鼠体内自由基代谢平衡的失调。
表4 SIBC对去卵巢大鼠血液和主要组织SOD活性的影响Table 4 Effects of SIBC on blood and main tissue SOD activity of OVX
2.6 SIBC对去卵巢大鼠丙二醛(MDA)含量的影响
模型组大鼠的血液及组织MDA含量升高,其中血液、肝MDA含量与对照组相比,有显著性差异(p<0.05)。在给予SIBC后,中剂量组的血液和肝MDA水平分别比模型组下降了31.2%、30.6%,有显著性差异(p<0.05),接近对照组水平;中剂量组的脾和高剂量组的肝、肾MDA也分别比模型组下降了19.8%、26.5%、18.6%,有显著性差异(p<0.05)(见表5)。提示SIBC能降低MDA含量,对骨质疏松症大鼠体内氧化应激所致的脂质过氧损伤有较好的抑制作用。
表5 SIBC对去卵巢大鼠血液和主要组织MDA含量的影响Table 5 Effects of SIBC on blood and main tissue MDA content of OVX
2.7 SIBC对去卵巢大鼠血脂的影响
SIBC对去卵巢大鼠血脂的影响结果见表6。造模后的模型组大鼠血清TC含量比对照组升高,HDL-C含量比对照组降低,有显著性差异(p<0.05或p<0.01),提示造模后动物的血脂代谢异常。在给予SIBC后,中、高剂量组的TC含量比模型组分别降低了14.0%和15.8%,且差异显著(p<0.05);低、中、高剂量组能极显著地提高HDL-C水平(p<0.01),分别比模型组提高了23.3%、21.2%、17.2%。SIBC对总脂含量变化无显著影响,但随剂量增加有降低的趋势。说明SIBC对去卵巢大鼠血脂水平有一定的调节作用,有利于骨质疏松病症的改善。
表6 SIBC对去卵巢大鼠血脂的影响Table 6 Effects of SIBC on blood lipid of OVX
3 讨论
3.1 SIBC能增加去卵巢大鼠的骨密度,抑制骨丢失,预防骨质疏松的发生
骨密度作为诊断骨质疏松和骨折危险程度的重要指标,目前被认为是反映骨质疏松的金标准[21],已经被广泛应用在临床诊断和动物实验的研究中。血清Ca、P及AKP等是骨转换的一些指标[22],当血清Ca、P偏低、AKP升高时可预测骨丢失,间接反映骨质疏松的一些病症。本研究中大鼠去卵巢后骨密度和骨Ca及血清Ca、P下降,AKP活性升高。表明去卵巢后由于雌激素代谢失调,造成成骨细胞和破骨细胞的活性增强,骨吸收大于骨形成,骨代谢的平衡被破坏导致骨量丢失,形成骨高转换型骨质疏松[23]。给予去卵巢大鼠SIBC后,能提高骨密度、骨和血清Ca水平,并能使升高的AKP活性恢复到正常值。补肾中药方剂可预防去势小鼠骨丢失,降低AKP水平[24],番茄红素能提高去卵巢大鼠骨密度,升高血清Ca、P含量,降低AKP活性[25],橄榄油能有效缓解去卵巢大鼠的骨质疏松,提高血清Ca浓度,降低AKP活性,但对血清P含量无影响[26],与本实验结果是一致的。说明SIBC不仅能增加骨密度,还可以通过调节骨转换的一些指标,减弱去卵巢大鼠骨吸收强度,增强骨形成,对高转换型骨质疏松有明显抑制作用。
锌参与骨骼的代谢,影响成骨形成[27],缺锌可导致骨代谢障碍。同时,锌也是CuZn-SOD的催化辅基。去卵巢大鼠血清Zn含量显著下降(p<0.05),可能是导致SOD活性下降的原因之一。SIBC能显著提高血清Zn含量,有助于维持正常骨代谢和抗氧化酶水平。
SIBC能降低骨质疏松的发生风险与其组分中的生物活性成分密切相关。染料木素是大豆提取物中具有雌激素样活性最强异黄酮成分之一,在SIBC中它的含量为0.1%。染料木素在浓度1~100 nmol/L 时就可以表现出刺激ERα、β转录活性的作用,并且主要与骨骼ERβ结合,染料木素作用于ERβ产生的相对雌激素样效应为作用于ERα时的30倍,能明显改善去势雄性大鼠血和尿的骨代谢生化指标[23],对去卵巢大鼠的骨密度、骨生物力学及相关生化指标都有改善作用[28],能有效预防绝经后妇女骨丢失[29]。牛初乳冻干粉含有多种调节骨代谢的生长因子,其中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)含量最高,检测含量为1146 ng/g,其中80%以上是以游离态存在[5]。IGF-1是骨源性生长因子成分之一,能够促进细胞的增殖分化,增强成骨细胞活性及其对钙磷的吸收[1]。补充外源性骨生长因子可促进成骨代谢、改善骨结构、提高骨密度[30]。牛初乳提取物对成骨细胞增殖及胎鼠骨骼发育有促进作用,在促进骨骼发育方面的效果优于活性钙,与其含有的IGF-1密切相关[6]。同时,SIBC含较高的免疫球蛋白(14.2%),能增强老年患者的免疫功能低下,减轻骨质疏松发生[31]。可见,SIBC中这些生物活性物质对预防骨质疏松起到了积极作用。
3.2 SIBC能清除ROS,降低体内氧化应激水平,有利于改善骨质疏松
SOD和MDA通常被作为用于评估氧化应激状态的可靠指标[33]。当体内氧化应激水平增高,抗氧化酶活性降低,ROS清除能力下降,过多ROS导致体内脂质过氧化反应加剧,产生MDA增多,引起骨组织氧化损伤。SOD是细胞内主要的酶性抗氧化剂,能清除ROS,保护机体免受氧化损伤,在氧化与抗氧化平衡中起着重要作用[34]。MDA是脂质过氧化的终产物,已被广泛作为ROS损伤脂质分子的一个标记物[35],间接地反映出细胞受损情况。本研究表明,去卵巢大鼠血液和组织SOD活性下降,MDA水平上升,说明去卵巢后导致了机体氧化应激反应发生。中、高剂量SIBC能提高去卵巢大鼠血液、肝、肾、脾SOD活性,降低血液、肝、肾、脾MDA含量。可见SIBC不仅在体外具有ROS清除活性,而且能清除体内自由基,减轻氧化应激所致的血液和组织氧化损伤,降低骨质疏松发生的风险。Ozgocmen等[36]研究显示,骨质疏松患者红细胞MDA含量显著高于正常组。番茄红素能增加去卵巢大鼠血清SOD活性,降低MDA含量[25]。Yalin等[37]发现,去卵巢鼠导致肝脏和肾脏中SOD活性下降,MDA水平上升。一些临床研究显示,骨质疏松患者血清MDA含量升高,而SOD等抗氧化剂的含量降低,提示骨质疏松发生时存在氧化损伤,体内氧化和抗氧化平衡被打破[38]。SIBC也同样显示了提高SOD活性、降低MDA含量,减轻去卵巢所致的氧化应激水平的作用。
研究表明,牛初乳提取物能提高老年人血清总SOD和Mn-SOD活性、降低脂质过氧化物水平[39],能提高血液SOD活性、降低心肌脂褐质合量[40],对吸收O3的小鼠具有抗自由基损伤作用[41]。最近研究显示,牛初乳冻干粉具有清除自由基作用[5]。牛奶抗氧化肽能通过增加成骨细胞基因表达和抗氧化酶活性来促进成骨细胞分化[7]。SIBC中的牛初乳成分无疑增强了ROS清除能力,对改善去卵巢大鼠的自由基平衡失调和骨细胞的氧化损伤有积极的改善作用。
3.3 SIBC对脂代谢紊乱有一定的调节作用,能减轻骨质疏松发生的风险
近年来研究显示,骨代谢和脂代谢存在着巨大关联,当脂代谢平衡被打破时,会导致骨代谢紊乱,继而引起骨质疏松、骨质流失和骨关节炎等骨代谢相关疾病发生[42]。本研究中去卵巢大鼠血清TC含量升高,HDL-C含量降低,提示造模后动物脂代谢异常。在给予SIBC后,能降低去卵巢大鼠血清TC含量,提高HDL-C水平。崔洪斌等[43]和史琳娜等[44]研究表明,大豆异黄酮能升高去卵巢大鼠血清HDL-C水平,降低血清TC水平。Potter等[45]对高胆固醇血症绝经妇女的干预实验显示,大豆蛋白可使血浆TC下降,而HDL-C水平上升。Kim等[46]研究表明,牛初乳能降低2型糖尿病患者的TC和TG水平,Davis等[47]和王小军等[5]在动物实验中也显示了牛初乳的降TC作用。可见,SIBC中的组分不仅对去卵巢大鼠的脂代谢紊乱能起到了一定的调节作用而且有利于降低骨质疏松发生的风险。
综上所述,复合制剂在体外具有ROS清除作用,是一种理想的抗氧化剂。在去卵巢大鼠骨质疏松症模型中,复合制剂能增加去卵巢所致的骨密度降低、提高血液和骨Ca水平,能增加血液和主要组织的抗氧化酶活性、降低脂质过氧化物含量,提高机体整体的抗氧化水平,同时,也能调节血脂代谢水平,对去卵巢大鼠所致骨质疏松症起到积极的改善和抗氧化作用。