天然复合保鲜涂膜液对卤鸭脖的保鲜效果研究

郗泽文,司昀灵,邹立强,刘 伟

(南昌大学食品学院,食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047)

酱卤肉制品在国内发展历史悠久,因风味和口感俱佳而备受消费者的喜爱[1]。然而由于长期以来的生产、销售和消费习惯,酱卤肉均以散装、鲜食为主,使得人们对酱卤肉制品的保鲜技术研究相对滞后[2]。

天然生物防腐剂如乳酸链球菌素(Nisin)、纳他霉素等因具有安全、高效等特点已成为国内外食品保鲜领域的研究热点[3]。Nisin是一种天然抗菌多肽,对大多数革兰氏阳性菌具有较好的抑菌效果,还具有较好的耐酸性以及在较低pH下的热稳定性[4]。纳他霉素是一种酯类抗真菌剂,是被FDA推荐的仅有的两种生物防腐剂之一,对霉菌、酵母菌有抑制作用,但其无抗细菌活性[5]。此外,可食用膜在肉制品保鲜领域中有着独特的优势,可改变表面微气调的环境,有效防止汁液流失和隔绝外界微生物,从而达到防腐保鲜的目的[6]。张晓春等[7]使用壳聚糖对卤鹅表面进行了涂膜保鲜应用。海藻酸钠具有良好的生物相容性和可降解性,且价格低廉、成膜性好,更重要的是已被国标允许添加在酱卤肉制品中,较适合作为肉制品的可食性膜材料。

由于海藻酸钠自身不具备抗菌性,故单独使用涂膜效果较差[8]。Nisin对革兰氏阳性菌,尤其是芽孢杆菌有很强的抑制作用,但它的抑菌谱较窄,因此可以与纳他霉素抑菌谱互补发挥协同增效的作用。目前,采用复配保鲜涂膜液延长卤鸭脖货架期的研究鲜有报道,本文以不同浓度的海藻酸钠、Nisin、纳他霉素对卤鸭脖进行保鲜处理,研究在储藏过程中卤鸭脖品质的变化,通过单因素实验选出三种保鲜剂最优浓度,然后进行L9(34)正交实验,进一步筛选得到最佳复合保鲜涂膜液,以期延长卤鸭脖的货架期。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

卤鸭脖产品 江西煌上煌集团有限公司(经原料鸭脖、盐腌、卤制、摊凉、切割、气调包装等环节完成产品的制作过程,包装盒内充N2)；Nisin、纳他霉素 浙江银象生物工程有限公司;海藻酸钠、碘乙酸钠、氯化钾、2-硫代巴比妥酸、甲基红、次甲基蓝、氧化镁等试剂 国药集团化学试剂北京有限公司;平板计数培养基 青岛海博生物技术有限公司;其它试剂 均为分析纯。

PL602-L型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;CR-400 色差计 日本柯尼卡-美能达公司;T6新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;K9840自动凯氏定氮仪 济南海能仪器股份有限公司;3110恒温培养箱 美国Thermo Fihser科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 保鲜液的制备 称取Nisin 0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2 g,分别溶于100 mL无菌水中,配制成浓度梯度为0～1.2 g/100 mL的Nisin保鲜液;称取纳他霉素0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.30 g,分别溶于100 mL无菌水中,配制成浓度梯度为0～0.30 g/100 mL的纳他霉素保鲜液;称取0、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 g的海藻酸钠分别加入100 mL无菌水中,70 ℃水浴加热3 h至溶液呈均一状态,冷却至室温后加入1.5%的甘油作塑化剂,得到浓度梯度为0～1.5 g/100 mL的海藻酸钠保鲜液。

1.2.2 保鲜液对卤鸭脖的保鲜处理 从4 ℃冷库中取出当日生产的气调包装卤鸭脖,在无菌操作台中取样分别浸没保鲜液10 s,置于筛网沥水沥干,转入聚乙烯袋真空包装。所有样品于4 ℃储藏第9 d测定指标,每次实验做三次平行。

1.2.3 单因素实验 采用单因素实验法,用不同浓度的Nisin、纳他霉素、海藻酸钠对卤鸭脖进行保鲜处理,真空包装后置于4 ℃储藏第9 d取样分别测定菌落总数、pH、TVB-N和TBARS值。海藻酸钠浓度设置为0、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 g/100 mL;Nisin 0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2 g/100 mL;纳他霉素浓度设置为0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3 g/100 mL。

1.2.4 正交优化实验 为了得到最佳的天然复合保鲜涂膜液,在单因素实验研究结果的基础上,以L9(34)正交设计方法优化海藻酸钠、Nisin与纳他霉素的最优组合水平,样品贮藏第9 d测定菌落总数、TBARS值、TVB-N值,作为保鲜效果的衡量指标。正交实验因素水平设置见表1。通过直观分析法得到影响测定指标的主次顺序和最佳配比,并用方差分析其结果。

表1 正交实验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 验证实验 取当日生产的气调包装卤鸭脖,在无菌操作台中取样浸没于最优组合的涂膜液10 s,置于筛网沥水沥干,转入聚乙烯袋真空包装,对照组为相同体积的无菌水。在第1、4、8、12、15 d测定肉样的菌落总数、pH、TBARS值、TVB-N值与色差值验证正交实验,筛选最佳复合保鲜涂膜液。

1.2.6 样品测定前处理 于无菌操作台中对鸭脖使用灭菌器械进行取样。用手术钳插入鸭脖中轴骨空心处以左手固定,右手持镊子沿纹理方向从鸭脖表面撕下肉样置于培养皿内,使用手术剪将其剪碎,备用待测。

1.2.7 指标测定

1.2.7.1 菌落总数的测定 参照GB 4789.2-2016食品安全国家标准 食品微生物菌落总数测定中的方法测定。

1.2.7.2 鸭脖pH的测定 准确称取5.0 g肉样,加入50 mL蒸馏水,剪碎后6000 r/min分散30 s后匀浆用pH计在室温下直接测定。

1.2.7.3 鸭脖脂质过氧化(TBARS)的测定 参照Xiong等[9]略作修改。称取10 g绞碎均匀的肉样,加入50 mL 7.5%三氯乙酸(含0.1% EDTA),摇荡30 min,过滤,取5 mL上清液,加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液并沸水浴加热40 min,取出冷却后离心(4000 r/min,20 min),取上清液并加入5 mL氯仿,摇匀静置分层,取上清在 532 nm处比色。计算公式如下:

TBARS(mg/kg)=(A532/Ws)×9.48

式中:A532为待测液在532 nm下的吸光度值;Ws为肉样品的质量(g)。

1.2.7.4 鸭脖挥发性盐基氮(TVB-N)的测定 参照GB/T 5009.228-2016自动凯氏定氮法进行测定。

1.2.7.5 鸭脖色差的测定 参照Noori等[10]的测定方法。取各样品鸭脖,使用色差计对鸭脖表面进行测定。自检后使用白板进行标准校正,每个样品随机测定5点。色度坐标L*、a*、b*被记录用于计算总色差值ΔE*。计算公式为:

1.3 数据处理

实验中每组数据均进行3次重复,使用SPSS 22.0(SPSS Inc.,USA)进行数据的统计分析,并对实验数据采用单因素方差分析(ANOVA)进行分析。当p<0.05时,认为组间差异显著。

2 结果与分析

2.1 海藻酸钠涂膜液最优浓度的确定

海藻酸钠涂膜在第9 d时理化及菌落总数指标的结果见表2,使用0、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 g/100 mL 海藻酸钠进行涂膜保鲜结果发现,空白组储藏第9 d时,空白组各项指标已腐败变质超标,而使用了海藻酸钠可食用膜涂膜的实验组各项指标均显著优于空白组(p<0.05)。海藻酸钠自身并不具备抗菌性及抗氧化性,从侧面说明海藻酸钠是通过可食用膜的形式覆盖在鸭脖表面,使其具备一定的保鲜作用，抑制需氧菌的生长[11]。最优的指标分别为菌落总数对数值(5.14±0.14)lg CFU/g、pH6.10±0.08、TBARS(1.98±0.09) mg/kg、TVB-N(18.28±0.27) mg/100 g,出现在海藻酸钠浓度为0.8～1.5 g/100 mL的实验组,表明海藻酸钠涂膜对卤鸭脖有抑菌作用及抗氧化效果,其中1.0～1.5 g/100 mL的实验组之间差异不明显,表明浓度在1.0 g/100 mL时已基本达到最优浓度。且高于1.0 g/100 mL浓度后菌落总数有所升高。此外,海藻酸钠作为多糖,也是一种微生物可以利用的碳源,且浓度过高会使得涂膜液变得粘稠。以上结论表明海藻酸钠可食用膜具备一定的保鲜作用,且最优浓度为1.0 g/100 mL。

表2 不同浓度海藻酸钠可食用涂膜保鲜的鸭脖第9 d的各项指标Table 2 Results for the 9th day of pot-stewed duck’s neck with different concentrations of sodium alginate edible film

2.2 Nisin最佳浓度的确定

由表3可见,在第9 d时,空白组的各项指标分别为菌落总数对数值(6.06±0.10)lg CFU/g、pH5.47±0.06、TBARS(2.73±0.06) mg/kg、TVB-N(22.26±0.47) mg/100 g,已经不能食用。抗菌剂Nisin的抑菌效果非常显著,由于Nisin对于细菌的抑制效果与有效浓度呈正相关[12],因此随着浓度增大其抑菌效果越显著(p<0.05),最大浓度Nisin的菌落总数对数值仅为(4.14±0.09)lg CFU/g。Nisin对于鸭脖微生物指标的影响进一步带动理化指标的变化,在0.8 g/100 mL时的pH逐步上升至(6.11±0.09)。表明鸭脖中的优势菌—乳酸菌被明显抑制[1],pH较空白组有显著性差异(p<0.05)。对于TBARS指标而言,Nisin浓度为0.8～1.2 g/100 mL时,组间差异不显著(p>0.05);而对于TVB-N指标而言,当Nisin浓度大于1.0 g/100 mL时,组间差异不显著(p>0.05)。结合测定指标与经济效益,得出0.8 g/100 mL的Nisin为最佳浓度。

表3 不同浓度Nisin保鲜的鸭脖第9 d的各项指标Table 3 Results of various indexes for 9th day of pot-stewed duck’s neck with different concentrations of nisin

2.3 纳他霉素最佳浓度的确定

从表4中可以看出,采用0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.30 g/100 mL纳他霉素实验发现第9 d空白组已完全腐败,而实验组各项指标均优于空白组。随着纳他霉素浓度升高,保鲜效果逐渐增强,但较Nisin而言其保鲜效果较弱。在浓度最高为0.30 g/100 mL时的各项指标分别为菌落总数对数值(5.28±0.03)、pH(5.61±0.08)、TBARS(2.56±0.04) mg/kg、TVB-N(18.86±0.42) mg/100 g。纳他霉素适用于表面灭菌,渗透性较差,且对真菌抑菌性显著高于细菌,但引起卤鸭脖腐败变质的主要微生物为细菌[1]。此外,虽然实验组各项指标显著高于(或低于)空白组,但当浓度高于0.15 g/100 mL时实验组间差异不显著(p>0.05),结合测定指标与经济效益,选择0.15 g/100 mL作为纳他霉素的最佳浓度。

表4 不同浓度纳他霉素保鲜的鸭脖第9 d的各项指标Table 4 Results of various indexes for 9th day of pot-stewed duck’s neck with different concentrations of natamycin

2.4 正交实验筛选最优组合

在对海藻酸钠、Nisin和纳他霉素进行单因素实验的基础上,使用正交设计优化三因素三水平得到最优组合。在储藏期间,以菌落总数、TBARS与TVB-N为评价指标进行分析。极差分析结果见表5,极差值(R)反映的是因素对检测指标的影响程度,R值越大表明对保鲜效果的影响越大。TBARS与TVB-N对卤鸭脖保鲜效果影响的因素顺序:海藻酸钠>Nisin>纳他霉素。菌落总数对数值对卤鸭脖保鲜效果影响的主次顺序:Nisin>海藻酸钠>纳他霉素。从方差分析结果(表6)可以得出保鲜涂膜液对卤鸭脖保鲜效果的显著水平,以TBARS来观察,海藻酸钠影响极显著(p<0.01),Nisin影响显著(p<0.05);以TVB-N来观察,各因素对实验结果均有显著影响(p<0.05),其中海藻酸钠对TBARS与TVB-N实验结果为极显著影响(p<0.01)。以菌落总数对数值来观察,只有Nisin具有显著性影响(p<0.05),而纳他霉素无显著性影响(p>0.05)。根据表5各测定指标的K值确定各因素的最优水平组合。菌落总数:A2B3C3;TBARS:A3B3C3;TVB-N:A2B2C3。由于各项指标分析得到的最优组合均不一致,考虑到国家标准对于酱卤熟肉制品仅明确了菌落总数的限制,而对TBARS与TVB-N未作规定,经综合平衡分析[13],得到最优组合为A2B3C3,即海藻酸钠 1.0 g/100 mL、Nisin 0.9 g/100 mL、纳他霉素0.18 g/100 mL。

表5 正交实验结果及直观分析表Table 5 Results and visual analysis for orthogonal experiment

表6 L9(34)正交实验方差分析表Table 6 Variance analysis of L9(34)orthogonal experiment

2.5 最优组合的可食用膜涂膜液的保鲜效果验证

2.5.1 最优组合对卤鸭脖冷藏期间菌落总数的影响 如图1所示,菌落总数整体呈上升趋势,最优组合的涂膜液对菌落总数有较大的抑制作用,最优组合显著低于对照组鸭脖的菌落总数(p<0.05),在储藏8 d时对照组的菌落总数对数值就已达到(5.69±0.11)lg CFU/g,远超国家标准4.903 lg CFU/g[13]。而最优组合的菌落对数值仅为(4.49±0.07)lg CFU/g,低于国家标准,表明最优组合的可食用膜涂膜后的抑菌效果较好。到第12 d,由于微生物的大量繁殖,致使对照组较国家标准超出两个数量级,而最优组刚达到国家标准上限值,其菌落总数对数值为(4.90±0.08)lg CFU/g,这与对照组相比差异显著(p<0.05)。第15 d时，最优组菌落总数对数值为(5.37±0.08)lg CFU/g。最优组合中的海藻酸钠形成的可食用膜隔绝了氧气,抑制了需氧菌的生长。然而,据报道真空包装对乳酸菌这一专性厌氧菌的生长有利[14],而Nisin能抑制乳酸杆菌属在内的大部分革兰氏阳性菌及其芽孢的生长和繁殖。此外,菌落总数与TVB-N的趋势相一致,可能是因为微生物的生长促进了蛋白质等营养成分的降解[15]。综上,最优组合可以达到显著抑菌保鲜的效果。

图1 最佳复配组合对卤鸭脖冷藏期间的菌落总数对数值的影响

2.5.2 最优组合对卤鸭脖冷藏期间pH影响 乳酸菌是卤鸭脖中的优势腐败菌[1],可以代谢产酸使pH下降,而蛋白质经微生物分解生成胺类物质则使pH上升。卤鸭脖在冷藏期间pH变化情况如图2所示,随着时间的延长,两组的 pH均呈现先下降后上升的趋势,且对照组均显著低于最优组(p<0.05),原因可能是脂肪酸化和糖原分解产酸,致使对照组鸭脖冷藏初期呈弱酸性[16];从第8 d开始,对照组 pH呈现显著上升趋势,可能是由于此阶段的微生物快速生长,新陈代谢产生了碱性含氮物质如胺和三甲胺等，导致pH急速上升[15]。而最优组合pH的拐点也出现在第8 d,之后pH出现了显著性增加(p<0.05)。从侧面说明,最优组合的添加有效抑制了微生物的生长。在第12 d时,对照组的肉样已经完全腐败,大量繁殖的微生物促使对照组在8～15 d pH显著增长(p<0.05),而最优组在第15 d时的pH为(5.85±0.06)与第4 d时无显著性差异(p>0.05)。可见,最优组合可达到非常显著的保鲜效果,这一实验结果与李婷婷等[17]关于储藏期间糖原经糖酵解产酸,而后微生物分解蛋白质等产生的碱性物质使其pH先下降后上升的研究结论一致。由此,可以看出最优组合对卤鸭脖具有明显的保鲜效果。

图2 最佳复配组合对卤鸭脖冷藏期间的pH影响

2.5.3 最优组合对卤鸭脖冷藏期间TBARS值影响 从图3可以看出,在储藏期间,对照组与最优组合的TBARS值变化趋势均与时间呈正相关,这可能是由于不饱和脂肪酸在氧的作用下发生了脂质氧化,其生成的醛和酮使得TBARS值升高[18]。在储藏第1 d时,最优组合的TBARS值就已显著低于对照组(p<0.05),两组的TBARS值均呈显著上升趋势(p<0.05),并且对照组均显著高于最优组(p<0.05),表明最优组合不仅在最初就表现出了抗氧化作用,在整个储藏过程中都参与抑制脂质的过氧化。第15 d时，最优组TBARS值为(2.68±0.08) mg/kg。海藻酸钠具有良好的成膜性,能够有效阻隔氧气接触样品,且复合涂膜液中的Nisin与纳他霉素对微生物的抑菌作用进一步抑制了脂质氧化。可见,复合保鲜涂膜液可达到较好的保鲜效果。

图3 最佳复配组合对卤鸭脖冷藏期间的TBARS值影响

2.5.4 最优组合对卤鸭脖冷藏期间TVB-N值的影响 由图4可知,随着时间的延长,两组的TVB-N值均呈现上升的趋势,并且对照组均显著高于最优组(p<0.05),这可能是因为肉中蛋白质被降解为氨及胺类代谢产物的程度逐渐增大,使得挥发性盐基氮值显著升高[19]。初始时对照组与最优组的TVB-N含量均小于10 mg/100 g,对照组在第8 d时TVB-N值高达(18.76±0.63) mg/100 g,而最优组TVB-N值仅为(13.97±0.37) mg/100 g,说明最优组对卤鸭脖的 TVB-N值的增长有抑制作用。直到第15 d最优组的TVB-N值仅为(20.86±0.79) mg/100 g,而对照组已达到(27.84±0.49) mg/100 g,表明最优组合有效抑制了产胺类微生物的生长。这与测定的菌落总数趋势相一致。因此,与对照组相比,最优组合的复合保鲜涂膜液的保鲜效果较好。

图4 最佳复配组合对卤鸭脖冷藏期间的TVB-N值影响

2.5.5 最优组合对卤鸭脖冷藏期间色差值的影响 如图5所示,更高的ΔE*表示与原始色差相比变化较大。对照组在第8 d时ΔE*值为1.50±0.14,第15 d时ΔE*值高达2.34±0.13,与初始色泽变化显著(p<0.05)。而最优组在冷藏第12 d仍能保持ΔE*值为1.40±0.04,最优组合的复合涂膜液有效地抑制微生物的生长,减少色泽的波动。海藻酸钠可食用膜使鸭脖表面更加鲜亮,这是因为可食用膜隔绝了氧气进一步阻止了脂质过氧化。第15 d时最优组的颜色呈深褐色,ΔE*值为1.51±0.07,汁液流失较少,而对照组已长出可见菌斑。由此可见,最优组合对延长卤鸭脖货架期有明显效果,且不影响其外观。

图5 最佳复配组合对卤鸭脖冷藏期间的色差值影响

3 结论

通过正交试验获得了三种天然保鲜剂的最优组合,结果表明复配使用后保鲜效果增强,天然保鲜剂Nisin 和纳他霉素对海藻酸钠可食用膜涂膜鸭脖的协同保鲜作用明显,最优组合为海藻酸钠 1.0 g/100 mL、Nisin 0.9 g/100 mL、纳他霉素0.18 g/100 mL。卤鸭脖在涂膜后冷藏第15 d菌落总数对数值、挥发性盐基氮(TVB-N)、pH、TBARS和色差值分别为(5.37±0.08)lg CFU/g、(20.86±0.79) mg/100 g、(5.85±0.06)、(2.68±0.08) mg/kg、(1.51±0.07),均显著优于对照组(p<0.05),最优组合能有效抑制鸭脖腐败变质,保持肉样新鲜度,延长卤鸭脖冷藏货架期。