非靶向快速筛查茶饮料中未知农药残留

伍颖仪,陈 中,张思群,张 弘

(1.华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州 510640;2.合生元(广州)健康产品有限公司,广东广州 510663;3.广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心,广东广州 510623;4.亨氏(中国)投资有限公司,广东广州 510900)

随着社会经济的发展,人们对食品安全的关注日益提升,食品中农药残留作为影响食品安全的重要因素更是人们关注的重点。目前,农药残留检测的前处理方法有液液萃取法[1]、QuEChERS法[2]、固相萃取法[3]、基质固相分散法[4]、分散液液微萃取法(DLLME)[5-6]等。其中分散液液微萃取法是一种新型样品前处理技术。近年来发展迅速,具有操作简便、富集倍数高、快速,尤其是具有有机溶剂用量少等优点,已经逐步在农药残留检测领域应用[7]。

目前,农药多残留的筛查方法主要有气相色谱-质谱法[8-9]、气相色谱-串联质谱法[10-11]、液相色谱-串联质谱法[12]、气相色谱-四极杆-飞行时间质谱法[13]和液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法等[14-15]。以单四级杆和串联四级杆等为代表的低分辨质谱由于灵敏度较低等问题应用受到限制,以四极杆飞行时间质谱为代表的高分辨质谱具有出色的一级和二级质谱分析性能、高质量精度和无需标准物质定性等优势,能同时高通量地筛查大量农药,在农药多残留筛查检测方面得到了广泛应用,为农药的科学合理使用提供了有效的监管手段。四极杆-飞行时间质谱可根据化合物的精确质量数、保留时间、同位素强度、同位素分布和二级碎片等质谱信息匹配特定的数据库,实现化合物的无标准品快速筛查,理论上可同时扫描目标物的数量无上限,真正实现高通量分析[16-18]。四极杆-飞行时间质谱的高分辨率和高质量精度的特点可以有效降低化学噪音,从而提高定性结果的可靠性和定量结果的准确度,尤其适合复杂基质体系中未知化合物的痕量分析[19]。

目前茶饮料中农药残留筛查以靶向筛查为主,非靶向筛查的方法未见报道。DLLME法作为前处理技术用于农药残留检测的应用已有应用报道。四极杆-飞行时间质谱筛查食品中的农药残留技术也比较成熟。但将二者结合起来对茶饮料中的农药残留进行检测则未见报道。本试验以茶饮料作为研究基质,采用DLLME法前处理技术,采用液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法对茶饮料中常用农药进行无标准品非靶向快速定性筛查，并对筛查方法的准确性、稳定性、检测水平等方面进行评估，以期将方法应用到茶饮料样品的实际筛查和检测过程中。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红茶、绿茶、乌龙茶饮料样品 购自超市;异丙威、克百威、敌敌畏、毒死蜱、马拉硫磷、甲氰菊酯、戊唑醇、丙环唑、啶虫脒、吡虫啉、异丙甲草胺、多杀霉素、百克敏标准品 纯度大于98%,德国Dr.Ehrenstorfer公司，购自上海安谱公司;甲醇、甲酸、乙腈、正丙醇、乙醇、丙酮、异丙醇 HPLC级,美国Thermo Fisher公司;1-溴-3-甲基-丁烷、溴苯、1-溴辛烷、溴环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、中性氧化铝(Al-N)、碱性氧化铝(Al-B)、硅胶键合十八烷基(C18)、氨丙基粉(NH2)、石墨化炭黑(GCB)、N-丙基乙二胺(PSA) 分析纯，购自上海安谱公司;实验用水 为Milli-Q超纯水。

TripleTOFTM5600+高分辨质谱仪 美国AB SCIEX公司;岛津LC-20AD液相色谱系统 日本岛津公司;Milli-Q Advantage A10 超纯水系统 法国Merck Millipore公司;4k-15离心机 德国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 准确称取5 g样品于50 mL聚四氟乙烯塑料离心管中,加入2 g N-丙基乙二胺粉末,涡旋震荡10 min,于10000 r/min离心5 min,转移上清液于15 mL聚四氟乙烯塑料离心管中,加入0.2 mL三氯甲烷、0.1 mL甲醇,摇床震荡5 min,于4000 r/min离心10 min,取下层提取液用乙腈定容至0.2 mL,供HPLC-Q-TOF测定。

1.2.2 仪器条件

1.2.2.1 色谱条件 色谱柱:Xbridge BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,3 μm);进样体积:5 μL;流速0.5 mL/min;柱温:40 ℃;流动相为乙腈(B)-0.1%甲酸(A),梯度洗脱程序如表1。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure of mobile phase

1.2.2.2 质谱条件 离子源:ESI和APCI复合源;APCI源:连接AB sciex公司自动校正系统(CDS),每10个样品自动校正一次,校正液流速0.40 mL/min;一级TOF-MS扫描准确质量范围:100～1000 Da;数据采集时间:100 ms;二级IDA-MS扫描准确质量范围:50～1000 Da;高灵敏模式;数据采集时间:50 ms;信号阈值:100 cps;IDA实验每循环采集6次数据,动态背景减法扣除。离子模式为ESI+,锥孔电压5500 V,离子源温度650 ℃,去簇电压90 V,碰撞能量为20、35、50 eV叠加,监测模式为TOF-IDA-MS。

1.2.3 方法的优化 方法的优化均以回收率为考察指标,加标含量均为1.0 μg/kg,按照GB/T 27404-2008[20]规定当加标量小于100 μg/kg时,回收率可接受范围为60%～120%。

这是一场死亡的舞会。凡是参加了这个舞会的鬼子，都是在赴一场死亡之舞，非死即伤。鬼子被炸懵了，再也顾不得武士道精神，掉转屁股赶紧往山下撤。

1.2.3.1 吸附剂及用量的选择 使用空白的乌龙茶饮料样品加入13种质控农药分别考察6种吸附剂(Al-N、Al-B、C18、NH2、GCB、PSA)对回收率的影响。准确称取5 g样品(n=6)于50 mL聚四氟乙烯塑料离心管中,分别加入2 g上述吸附剂粉末,涡旋震荡10 min,于10000 r/min离心5 min,转移上清液于15 mL聚四氟乙烯塑料离心管中,加入0.2 mL三氯甲烷、0.1 mL甲醇,摇床震荡5 min,于4000 r/min离心10 min,取下层提取液用乙腈定容至0.2 mL,供HPLC-Q-TOF测定。确定最佳吸附剂以后,将其用量设置为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g,考察吸附剂的使用量对回收率的影响。

1.2.3.2 萃取剂及用量的选择 使用空白的乌龙茶饮料样品加入13种质控农药分别考察6种萃取剂(1-溴-3-甲基-丁烷、溴苯、1-溴辛烷、溴环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷)对回收率的影响。前处理操作除加入的萃取剂不同外,其他操作同1.2.3.1,HPLC-Q-TOF测定。确定最佳萃取剂以后,将其用量设置为50、100、150、200、250、300 μL,考察萃取剂的使用量对回收率的影响。

1.2.3.3 分散剂的选择 使用空白的乌龙茶饮料样品加入13种质控农药分别考察6种分散剂(甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、正丙醇、异丙醇)对回收率的影响。前处理操作除加入的分散剂不同外,其他操作同1.2.3.1,HPLC-Q-TOF测定。

1.2.4 方法学考察 由于液相色谱-串联质谱仪的基质影响很明显,所以本方法采用空白基质配制校正曲线。将13种农药的混合标准溶液用空白样品提取液稀释配制成2.00～400 μg/L的系列基质标准溶液,在1.2.2的分析条件下对其进行测定,以峰面积(y)对浓度(x)做标准曲线。按10倍信噪比计算定量限,3倍信噪比计算检出限。分别向红茶、绿茶和乌龙茶饮料空白样品中添加13种农药的混合标准溶液,添加水平分别为0.5、1.0、5.0 μg/kg,然后按照本实验方法进行预净化、提取和检测。每个加标水平重复6次测定,并计算回收率和精密度。

1.2.5 筛查方法 高分辨质谱数据在AB Sciex公司的Analyst TF 1.6软件采集,采用PeakView2.0软件对实际样品中的农药残留进行筛查,由农药化合物列表进行检索,在PeakView2.0软件中调用已建立的农药化合物列表,设置相应的检索参数:精确质量偏差为±1×10-5,离子化模式设定为+H模式。软件会计算化合物的实测值与理论值的偏差,通过分子离子的精确质量偏差、同位素比、二级碎片和保留时间给出相应的检索匹配得分值,对于检索结果综合得分≥85的化合物,本方法确认其为检出农药。

2 结果与讨论

2.1 非靶向快速筛查农药残留的质控方法优化

为保证样品前处理过程、整个色谱保留时间和高分辨质量数的精确度和准确度,实现筛查结果的准确性,挑选13种农药进行质控实验。选择的农药包括有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、大环内酯和烟碱类杀虫剂、杀菌剂和除草剂。选择依据是尽量覆盖常见的农药、极性跨度大和出峰时间分散,能够有效监控非靶向筛查过程中整体实验条件的稳定性,确保筛查结果稳定可靠。13种质控农药分别在1.2.2节条件下进行实验,优化分散液液微萃取前处理条件。

图1 不同吸附剂对13种质控农药回收率的影响

图2 PSA用量对13种质控农药回收率的影响

2.1.2 萃取剂及用量的选择 萃取剂是影响萃取效率的重要因素,应具有较强的疏水作用且对目标物有良好的萃取能力。实验比较了1-溴-3-甲基-丁烷、溴苯、1-溴辛烷、溴环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷6种有机溶剂的萃取效果。考察的6种溶剂提取效果见图3。结果表明,三氯甲烷对所有的农药具有良好的提取效率,其次是二氯甲烷和溴苯。可能是由于三氯甲烷和二氯甲烷的极性较大,根据相似相溶原理,13种农药属于极性化合物，易溶于极性有机溶剂。使用三氯甲烷作为提取剂的回收率满足要求，所以选择三氯甲烷作为萃取剂做进一步研究。本实验分别用50、100、150、200、250、300 μL的三氯甲烷进行萃取,考察了萃取剂体积对萃取回收率的影响。结果如图4所示,当萃取剂体积低于50 μL时,下层无法回收到有机相,可能由于萃取剂量太少,在分散剂的作用下完全溶于样品中。随着三氯甲烷体积增大,回收率也增大,而当三氯甲烷体积大于200 μL时,回收率增大已不明显,所以三氯甲烷200 μL是最佳萃取体积。

图3 不同萃取剂对13种质控农药提取效果的影响

图4 提取剂用量对13种质控农药回收率的影响

2.1.3 分散剂的选择 分散剂的类型是影响液液微萃取萃取效率的关键因素,通常要求分散剂要能同时溶于萃取剂和水,使萃取溶剂在水相中分散成细小的液滴,增大其与待测物的接触面积。这些液滴在分散萃取的过程中对目标物进行连续萃取,促进形成水/分散剂/萃取剂三元乳浊液体系,快速完成分析物在水溶液与萃取剂之间的分配平衡,从而提高萃取效率。因此选择合适的分散剂对提高方法的萃取率十分重要。在本实验中,分别考察了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、正丙醇、异丙醇作为分散剂对萃取效果的影响。结果见图5,测定结果表明,甲醇、乙醇和异丙醇作为分散剂时,回收率均在可接受范围内,三种分散剂比较后,甲醇最好。正丙醇作为分散剂时,多杀霉素回收效果不好。乙腈和丙酮作为分散剂时,大部分农药回收率偏低。这是因为偏极性的分散剂更有利于三氯甲烷在样品中分散。因此,本研究选取甲醇为分散剂。

图5 不同分散剂对13种质控农药提取效果的影响

2.1.4 质控农药定性定量依据 本研究选择13种农药作为目标分析对照参考物质。首先将13个目标化合物进行HPLC-Q-TOF-MS分析,获得目标化合物高分辨质谱数据信息;根据一级TOF-MS和二级IDA-MS质谱信息定性定量分析目标化合物。13个目标化合物的定性定量分析质谱数据依据见表2。13种质控农药的实测质量精度较好,误差均小于10-6Da。

表2 13种农药化合物高分辨质谱数据Table 2 Mass spectrometry parameters data for 13 pesticides

2.1.5 线性范围与检测限 样品中13种农药的含量,根据目标化合物的一级TOF-MS高分辨质谱信息进行分析。首先利用LC-Q-TOF-MS分析方法获得目标化合物的离子流色谱,13种目标化合物配制成混合标准溶液,并使用空白基质溶液稀释成一系列质量浓度,获得目标化合物的校正曲线以及线性范围;同时以3倍信噪比和10倍信噪比依据,确定方法的检测限与定量限。13种目标化合物的高分辨提取离子流图见图6。

图6 13种质控农药的提取离子流色谱图

结果表明,空白基质校准曲线的R2在0.9989以上,检测限为0.002～0.092 μg/kg,定量限为0.006～0.307 μg/kg。相关参数见表3。由质控农药的定量分析结果可知,本方法检出限低,灵敏度高,可用于非靶向农药残留快速筛查。

表3 13种质控农药的校准曲线、检测限与定量限Table 3 Calibration curves,LOD and LOQ of 13 kinds of quality-controlled pesticides

2.1.6 质控农药精密度数据 分别对绿茶、红茶和乌龙茶3种基质进行添加回收实验。

每种基质添加3个不同浓度水平标准溶液,按实验方法进行测定,每个浓度水平做6份平行样品,回收率和相对标准偏差(RSD,%)结果见表4。由表4可知,3种不同基质样品的平均回收率范围在83.1%～96.8%,RSD范围在0.88%～4.82%,方法精密度及准确度良好,可用于非靶向农药残留快速筛查。

表4 13种质控农药回收率和相对标准偏差数据(n=6)Table 4 Recovery rate and relative standard deviation of 13 kinds of quality-controlled pesticides(n=6)

续表

2.2 非靶向农药残留快速筛查验证

基于13种质控农药优化的结果可知,本方法建立的筛查方法稳定性好、灵敏度高,可扩展到有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、大环内酯和烟碱类杀虫剂、杀菌剂以及酰胺类和三唑类除草剂同类别的农药的非靶向筛查。为验证本筛查方法的可靠性,在乌龙茶饮料样品中添加2 μg/kg与质控农药同类别的农药(莠去津、醚菌酯、噻虫啉、丁硫克百威、乐果),在未知添加农药品种的情况下,按照1.2.1的经前处理后供HPLC-Q-TOF/MS测定。将待筛查的所有农药分子式导入Peak View 2.0即可构成筛查数据库。采集的一级质谱图包含化合物的精确质量数和同位素比值。使用一级谱图对筛查出的可疑农药进行同位素分布和精确质量数进行匹配分析。如果同位素分布得分大于90且精确质量数误差小于± 1×10-5,再进行二级碎片信息进行匹配。通过Chem Draw Ultra 14.0软件绘制可疑农药的结构式,并将其导入Peak View 2.0软件中,将结构与二级碎片进行匹配,结合相应的检索匹配得分值判断目标化合物是否检出。以除草剂莠去津筛查为例,建立非靶向定性筛查农药的分析方法时,现将其分子式输入筛查列表中,并定义离子化模式为[M+H]+,得到的提取离子流色谱图见图7(A)。其提取精确质量数误差小于1×10-5,可进一步进行同位素分布分析,见图7(B)。由于可疑目标峰的同位素分布与莠去津相似,可调用其二级质谱图,结合其结构式进行结构与二级精确质量数的匹配,结果见图7(C)。可疑目标峰的三个主要碎片都和莠去津结构完全匹配上,三个碎片精确质量数误差小于0.0001 Da。综合匹配分值为90,可判定为检出莠去津。其它农药的筛查模式与上文一样。在未知添加农药品种的情况下,5种添加用于验证筛查方法的农药均定性检出,筛查准确率为100%。依据欧盟标准2002/657/EC,高分辨定性方法要求只需母离子和1个子离子的精确质量数即可。因此,本试验方法所建立茶饮料中的农残非靶向定性筛查技术可满足方法学要求。

图7 莠去津定性筛查图示

3 结论

本实验利用液相色谱-四极杆-飞行时间质谱建立了茶饮料中的农残非靶向筛查方法。通过添加13种农药作为质控化合物,优化了分散液液微萃取方法对茶饮料样品的前处理条件。最佳前处理组合为:N-丙基乙二胺为预净化剂,用量为2 g;三氯甲烷为萃取剂,用量为200 μL;分散剂为甲醇。质控化合物的回收率范围为83.1%～96.8%,RSD范围在0.88%～4.82%。空白基质校准曲线的范围为2～400 μg/L,决定系数R2大于0.9989,检测限为0.002～0.092 μg/kg,定量限为0.006～0.307 μg/kg。数据通过软件处理,比对目标化合物母离子的精确质量数、同位素比例等信息,结合二级碎片谱图与结构匹配技术,无需对照标准品即可同时筛查和确认茶饮料中的与13种质控化合物性质类似的多种农药残留。本方法的建立可为茶饮料中未知农残快速筛查和质量控制提供技术依据。