复合酶协同水解法制备绿豆抗氧化多肽

马诗文,高 云,*,韩思杨,汤 梅,陈 如,李彤彤,方志刚,陆永祯

(1.辽宁科技大学化学工程学院,辽宁鞍山 114051;2.辽宁科技大学创新创业中心,辽宁鞍山 114051)

绿豆又称青小豆,是豆科豇豆属一年生草本植物绿豆的成熟种子,具有解毒消肿、消暑利尿和抗氧化作用[1]。绿豆多肽是绿豆分离蛋白经水解而成的低聚肽混合物,由于相对分子质量较小,具有水溶性高、黏度低、稳定性强等特性[2-3],人体极易吸收,可提高机体免疫力[4-5],降低胆固醇、改善肾功能[6],还具有很强的抗氧化性,可作为新型抗氧化剂使用[7-8]。我国绿豆资源丰富,价格低廉,目前绿豆产品的深加工主要集中在绿豆淀粉的利用和生理活性物质提取等方面[9-10],生产中的绿豆蛋白等副产物含量高,营养价值丰富,尚未得到充分利用,制备绿豆多肽是绿豆蛋白综合利用的有效途径。

优化绿豆蛋白的水解条件是改进制备绿豆多肽的重要方法,蛋白酶的选择及其酶解条件对绿豆多肽的制备以及抗氧化活性有着重要的影响[11-12]。目前,国内对绿豆多肽的研究多集中在单酶水解的研究。卢珍华等[13]通过研究木瓜蛋白酶对绿豆蛋白的水解作用,确定最佳反应条件为:酶浓度8%,底物浓度9%,反应温度65 ℃,反应时间3 h,pH6.5。傅亮等[14]以碱性蛋白酶酶解制备绿豆多肽,得到最佳酶解条件下的水解度为23.09%。顾薇等[15]利用中性蛋白酶对绿豆分离蛋白进行酶法水解以制备寡肽,水解度的平均值可达28.82%。但是以复合酶协同水解绿豆蛋白制备绿豆多肽的研究尚未见报道。

本研究以绿豆蛋白为原料,以水解度为控制指标,选取碱性蛋白酶及中性蛋白酶复合,提供复合酶协同水解制备绿豆抗氧化肽的最佳工艺条件,为制备绿豆多肽提供了新思路。通过单因素实验和正交试验优化绿豆蛋白酶解的最适条件,并对绿豆抗氧化肽的自由基清除能力进行研究,为绿豆产品的深加工及综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绿豆蛋白 哈尔滨哈达淀粉有限公司;中性蛋白酶(酶活力50000 U/g)、碱性蛋白酶(酶活力200000 U/g) 安琪酵母股份有限公司;DPPH Sigma公司;氢氧化钠、甲醛、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、无水乙醇、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、Tris-HCl缓冲溶液、邻苯三酚、VC国药化学试剂有限公司。

FA2004N型电子分析天平 上海精密仪器仪表有限公司;DF-101型集热式恒温加热磁力搅拌器 北京世纪森朗实验仪器有限公司;PHSJ-5型实验室pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;HH-8型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;DT5-1型低速离心机 北京时代北利离心机有限公司;722S型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 绿豆抗氧化多肽制备工艺流程 配制一定浓度的绿豆分离蛋白水溶液,控制温度值为85 ℃水浴保温15 min。达到反应温度值后,调节pH至适当值,冷却到酶适宜温度保温。加入水解所需的蛋白酶,将得到的水解液放入水浴锅中进行恒温酶解反应。反应适当时间取出置于沸水浴中加热15 min以灭酶。将灭酶后的酶解液冷却至40 ℃,于离心机中以4000 r/min离心分离15 min,取出上清液待用。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 pH对酶解效果的影响 在底物浓度为8%、酶解温度为54 ℃、酶用量为4%等条件相同的情况下,调节pH分别为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,用中性蛋白酶与碱性蛋白酶1∶1复合对绿豆蛋白进行水解,水解3 h,以水解度为指标,考察pH对酶解效果的影响。

1.2.2.2 温度对酶解效果的影响 在底物浓度为8%、pH为8.0、酶用量为4%等条件相同的情况下,分别在酶解温度为46、48、50、52、54、56、58 ℃时,用中性蛋白酶与碱性蛋白酶1∶1复合对绿豆蛋白溶液进行水解,水解时间为3 h,以水解度为指标,考察酶解温度对酶解效果的影响。

1.2.2.3 底物浓度对酶解效果的影响 在pH为8.0、酶解温度为54 ℃、酶用量为4%等条件相同的情况下,用中性蛋白酶与碱性蛋白酶1∶1复合对绿豆蛋白溶液进行水解,分别改变底物浓度为4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%,水解时间为3 h,以水解度为指标,考察底物浓度对酶解效果的影响。

行间清耕、间作小麦、自然生草3个处理按照顺序分别选定10株苹果幼树；测定2015年苹果幼树的定干高度、生长量；2016年测定苹果幼树生长状况；测定苹果幼树中心干和分枝中部的20片叶片长宽、叶柄长粗及叶绿素含量等，用数显游标卡尺测定叶片长宽和叶柄长粗；用TYS-A型叶绿素测定仪测定叶片叶绿素含量，每个叶片测4个部位。在行间清耕、间作小麦、自然生草3个处理分别选6行树，每行选一个灌溉带，调查苹果幼树成花株数和每株成花树的成花数。

1.2.2.4 酶用量对酶解效果的影响 在底物浓度为8%、pH为8.0、温度为54 ℃等条件相同的情况下,用中性蛋白酶与碱性蛋白酶1∶1复合对绿豆蛋白溶液进行水解,分别改变酶用量为2%、3%、4%、5%、6%、7%,水解时间为3 h,以水解度为指标,考察酶用量对酶解效果的影响。

1.2.3 复合酶加酶方式实验 复合酶协同水解实验选取催化作用效果好的中性蛋白酶及碱性蛋白酶两种酶作为复合酶组合,按照以下水解步骤进行:先将其中一种蛋白酶加入绿豆蛋白溶液中,考虑反应结束后是否进行灭酶,再加入第二种蛋白酶,水解一定时间后终止反应,实验设计见表1。

表1 复合酶加入方式对水解度的影响Table 1 Effect of composite enzyme addition method on hydrolysis degree

1.2.4 正交试验设计 根据单因素实验结果,以pH、酶解温度、底物浓度、酶用量为影响因素,以水解度为指标,对复合水解绿豆蛋白制备绿豆多肽进行L9(34)正交实验进行优化,把单因素实验中得出的最佳条件确定为各因素的中间水平,实验因素及水平见表2。

表2 L9(34)正交实验因素水平表Table 2 Factors and levels of L9(34)orthogonal experiment

1.2.5 水解度的测定 水解度的测定采用甲醛滴定法[16]。取适量绿豆蛋白水解液,加入60 mL去CO2蒸馏水,用精密pH计调节pH为8.20,加入20 mL已中和pH为8.20的甲醛,然后用0.1000 mol/L标准NaOH溶液滴定pH到9.20,记下消耗NaOH的体积V1,用蒸馏水替代样品,同时做空白实验,记录空白实验消耗NaOH的体积V0,并用以下公式计算蛋白质的水解度。

1.2.6 DPPH自由基清除率的测定 取200 μL绿豆多肽溶液加入到5 mL 0.05 mmol/L DPPH无水乙醇溶液中,用无水乙醇定容到6 mL,摇匀,在室温下避光反应20 min,用无水乙醇做参比在517 nm处测定吸光度A0。用无水乙醇代替5 mL DPPH溶液,测定得到的吸光度为A1,并用以下公式表示样品对DPPH清除率[17]。

1.2.7 超氧阴离子自由基清除率的测定 采用邻苯三酚自氧化法测定[18]。取200 μL绿豆多肽溶液,加入到5.76 mL、pH8.2的50 mmol/L Tris-HCL缓冲溶液中,振荡混匀,在25 ℃水浴保温10 min后加入40 μL、25 mmol/L邻苯三酚(25 ℃水浴预热处理),迅速混合开始计时。测定5 min内在320 nm处的吸光度,每隔30 s读数一次。以蒸馏水代替样品溶液作为对照,分别将样品管和对照管作吸光度随时间变化得回归方程,其斜率为自氧化速率。记样品管自氧化速率为ΔA0,对照管自氧化速率为ΔA1,用以下公式表示样品对超氧阴离子清除率。

1.2.8 羟自由基清除率的测定 采用水杨酸法测定[14]。取200 μL绿豆多肽溶液,加入到5 mL 2 mmol/L硫酸亚铁溶液和5 mL、6 mmol/L双氧水溶液混合溶液中,摇匀后加入2 mL、6 mmol/L水杨酸溶液,混合后立即在510 nm测A0值。用蒸馏水代替样品溶液作为对照,测定得到的吸光度为A1。用以下公式表示样品对羟自由基清除率。

1.3 数据处理

每个实验重复三次,实验结果分析取平均值±标准差。采用Origin Pro 8.5进行作图、正交试验设计助手(II3.1)软件进行正交试验设计。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 pH对酶解反应的影响 酶的空间构型在酸碱不适宜的情况下会产生变化,从而导致酶失活;此外,pH会影响底物与酶的解离状态,影响蛋白质的水解程度。图1表明,复合酶协同水解绿豆蛋白的反应中,水解度的值会随着pH的变化而变化。水解反应在pH6.5～8.5的范围之间时,水解度测定结果会随pH的增加而上升。在pH为8.5时绿豆分离蛋白水解度最高,水解效果最好。当pH超过8.5时,水解度开始缓慢下降。说明pH为8.5时复合酶的酶活最强,水解效果最好。

图1 pH对水解度的影响

2.1.2 温度对酶解反应的影响 酶促反应中温度过高会对蛋白酶的稳定性产生影响,易致酶失活,其次酶促反应过程中,温度会分别影响酶与底物、酶与抑制剂、激活剂、辅酶的结合。由图2可知,不同温度条件下,反应水解度值表现不同。随着温度的上升水解度也在不断升高,温度控制为54 ℃的时候,水解绿豆蛋白得到的水解度较高,达到峰值,说明此时水解效果最好。而温度超过54 ℃时,水解度开始呈缓慢下降趋势,这可能是高温影响了酶本身的活性而影响了产物的水解度。

图2 温度对水解度的影响

2.1.3 底物浓度对酶解反应的影响 酶解反应中,底物浓度过高会增大水解液黏度从而产生底物抑制作用;此外,随着反应底物减少,酶量过剩会导致水解反应变慢。图3表明,随着底物浓度的增加,水解度也呈快速上升趋势,在底物浓度为10%时水解度达到最大,当底物浓度为9%时趋于平衡。综合考虑底物浓度对底物的抑制作用,认为复合酶水解绿豆蛋白在底物浓度为9%的时候,水解度较高,说明此时水解效果好,其次底物浓度为10%、8%、7%、6%、5%、4%。

图3 底物浓度对水解度的影响

2.1.4 酶用量对酶解反应的影响 酶用量即为标注活力/底物量,酶用量对酶与底物反应具有促进作用。图4表明,加入不同酶用量酶解绿豆蛋白溶液,水解度值也有所不同。由图4中上升趋势可知,酶用量数值越高水解度也在增加。根据上述的实验结果以及实验材料的经济性原则,认为选择酶用量3%、4%、5%进行正交试验。

图4 酶用量对水解度的影响

2.2 碱性蛋白酶和中性蛋白酶复合酶解水解条件的优化

2.2.1 复合酶加入方式对酶解水解度的影响 通过碱性蛋白酶和中性蛋白酶加酶顺序的差异以及加酶过程中是否进行灭酶,将复合酶两者比例设置为1∶1,研究复合酶加入方式对绿豆蛋白水解度的影响,复合酶加入方式对水解度的影响结果如表3所示。

表3 复合酶加入方式对水解度的影响Table 3 Effect of composite enzyme addition method on hydrolysis degree

由表3中数据可知实验序号4的实验结果最高,即碱性蛋白酶和中性蛋白酶复合酶协同水解的最佳加酶方式为先加入碱性蛋白酶,中间不需要经过高温灭酶处理,再加入中性蛋白酶酶解,这种加酶方式所得的酶解物水解度最高,水解度可达到30.89%。

2.2.2 正交实验设计及结果 在上述的碱性蛋白酶和中性蛋白酶复合酶法最佳加酶方式的条件下,对复合酶水解绿豆蛋白的最佳工艺条件进行优化。选取A(pH)、B(温度)、C(底物浓度)、D(酶用量)为4个因素,各取3个水平,以水解度为指标进行正交实验,实验结果如表4和表5所示。

表4 正交实验结果与分析Table 4 Results of analysis orthogonal experiment

表5 方差分析结果Table 5 Result of variance analysis

由正交试验结果可知:各个因素对双酶协同水解反应的水解度大小影响程度的主次关系为:A>D>B>C,即pH>酶用量>酶解温度>底物浓度,复合酶协同水解绿豆蛋白的最佳工艺条件是A3B3C1D2,即pH为8.5、温度56 ℃、底物浓度为8%、酶用量4%,根据此最佳工艺条件进行3次重复验证实验操作,实际测得的水解度平均值为33.95%,超过了此前各组酶解工艺水解度值。

2.3 绿豆抗氧化肽的抗氧化活性评价

抗氧化活性评价主要测定单酶水解物(为中性蛋白酶单酶水解绿豆蛋白的水解物)、复合酶水解物对DPPH自由基、超氧阴离子自由基及羟基自由基的清除率,探讨绿豆多肽在3种抗氧化体系中的抗氧化作用,并以VC和绿豆蛋白作为对照。

2.3.1 绿豆抗氧化肽清除DPPH自由基能力 由图5可知,各个样品都表现出一定的DPPH自由基清除活性,且活性均随样品浓度水平的提高而显著上升。在样品质量浓度达到0.4 mg/mL时,复合酶水解绿豆蛋白的水解产物DPPH自由基的清除率达到82.8%;对于单酶水解绿豆蛋白而言,清除能力最大为79.18%。而在相同浓度下,阳性对照VC的最大清除率为89.5%,绿豆蛋白的最大清除率为56.13%。这说明在相同浓度下VC清除DPPH·的能力表现最好,其次为复合酶水解绿豆蛋白的水解产物,单酶水解绿豆蛋白的水解物低于复合酶水解绿豆蛋白的水解产物而高于绿豆蛋白。

图5 绿豆多肽对DPPH·清除能力的影响

图6 绿豆多肽对清除能力的影响

2.3.3 绿豆抗氧化肽清除羟自由基能力 由图7可知,各个样品对OH·均具有较好的清除能力,且清除能力均随样品浓度水平的提高而提高。在样品质量浓度达到20 mg/mL时,四种样品对OH自由基的清除率趋于平稳;阳性对照VC的清除能力最大为69.51%,复合酶水解绿豆蛋白的水解产物最大值为56.85%,单酶水解绿豆蛋白清除能力最大为50.24%,绿豆蛋白的最大清除率为41.62%。这说明在相同浓度下复合酶水解绿豆蛋白的水解产物优于单酶水解绿豆蛋白的水解物清除OH·的能力。两者均低于VC,而高于绿豆蛋白。

图7 绿豆多肽对OH·清除能力的影响

3 结论

本实验通过复合酶协同水解法制备绿豆抗氧化活性多肽,并对绿豆多肽的抗氧化活性进行评价。通过单因素实验结合正交实验得到复合酶协同水解绿豆蛋白的最适反应条件为pH8.5,温度56 ℃,底物浓度8%,酶用量4%,水解度可以达到33.95%。同时发现绿豆抗氧化多肽对DPPH自由基、超氧阴离子自由基及羟自由基均有良好的清除能力,复合酶协同水解得到的绿豆抗氧化多肽对DPPH自由基、超氧阴离子自由基及羟自由基清除率分别为82.8%,76.82%和56.85%,表明绿豆多肽抗氧化效果明显,在保健食品领域有一定的开发利用价值。