皮肤E2F6蛋白表达水平与糖尿病周围神经病变患者预后的相关性研究

杨敏慧，刘爱群，李金海，向光红

糖尿病周围神经病（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）常见的并发症之一，主要表现为手套长袜样分布的肢端疼痛、麻木、无力等，晚期可致残[1]。慢性高血糖引起活性氧水平增高，导致机体处于氧化应激状态，损伤神经元和轴突，促进DPN发生[2]。E2F是转录因子，参与细胞周期控制、增殖分化和凋亡等。E2F6是E2F家族成员，可能与低氧诱导的细胞凋亡有关[3]。本研究通过检测皮肤的E2F6表达，探讨E2F6蛋白表达水平与DPN预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2016年1月至2017年12月我科收治的2型DM患者160例，均符合WHO关于DM的诊断标准[4]，根据有无周围神经病变将DM患者分为无病变DM组和DPN组。无病变DM组80例，男38例，女42例；年龄41～79岁，平均（55.34±8.56）岁；平均病程（8.97±2.21）年。DPN组80例，男37例，女43例，年龄42～80岁，平均（54.64±5.82）岁；平均病程（16.67±3.81）年。同期在本院就诊疑似小纤维神经病变后排除疾病的健康人80例纳入对照组，男40例，女40 例；年龄43～78岁，平均（56.01±7.71）岁。DPN组纳入标准：DM诊断明确；存在周围神经病变的临床和（或）电生理证据[4]；缓慢进展型周围神经病变。排除标准：营养障碍、化学物质损害、药物中毒等所引起周围神经病变；慢性炎症性脱髓鞘性多发性周围神经病；结缔组织病；并发DM急重并发症；恶性肿瘤。各组年龄、性别等一般资料差异无统计学意义（P＞0.05）；DPN组的病程长于无病变DM组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

1.2 方法

1.2.1 血液指标 采集所有研究对象的清晨空腹血，采用全自动生化分析仪（西门子ADVIA 2400）检测空腹血糖（fasting blood sugar，FBS）、糖化血红蛋 白（glycated hemoglobin，GHb）、甘 油 三 酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）；采用化学发光法（DADE-AR全自动分析仪）检测胰岛素水平；采用二硫代硝基苯甲酸比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）；采用黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）；采用硫代巴比妥法检测丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）。

1.2.2 皮肤E2F6蛋白定性和定量表达测定 常规皮肤消毒，切至真皮组织，取长约为0.5 cm，厚约0.2 cm的皮肤组织。采用免疫组化SP法检测皮肤组织的E2F6蛋白，羊抗人E2F6单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），E2F6阳性染色为黄色或棕黄色，表达部位在细胞质和（或）细胞核。阳性细胞的染色强度按无色、浅黄色、黄色和棕黄色分别计为0、1、2、3分；阳性细胞数计分：无阳性细胞0分，1%～10%计1分，11%～50%计2分，51%～80%计3分，≥81%计4分；染色强度和阳性细胞数的乘积0～3分为阴性，≥4分为阳性。采用CMIAS真彩色病理图像分析系统进行形态学定量分析表达强度。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组生化指标情况

无病变DM组及DPN组的FBS、GHb、空腹胰岛素、TG和TC水平均明显高于对照组（均P＜0.05）。DPN组的GHb、空腹胰岛素、TG、TC水平均高于对照组（均P＜0.05），无病变DM组及DPN组FBS差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组的生化指标比较（±s）

表1 各组的生化指标比较（±s）

注：与对照组比较，①P＜0.05；与无病变DM组比较，②P＜0.05

组别对照组无病变DM组DPN组例数80 80 80 FBS/(mmol/L)4.31±1.22 11.66±3.39①12.89±4.51①GHb/%4.28±0.54 9.79±2.31①13.84±3.35①②组别对照组无病变DM组DPN组TC/(mmol/L)4.34±1.33 6.38±1.28①7.85±1.60①②空腹胰岛素/(mIU/L)8.89±2.75 12.96±3.11①15.97±3.41①②TG/(mmol/L)1.28±0.32 3.79±1.19①4.95±1.74①②

2.2 各组氧化应激指标及皮肤E2F6蛋白表达比较

与对照组比，无病变DM组、DPN组的SOD、GSH-PX和E2F6蛋白水平较低，MDA水平较高（P＜0.05）；与无病变DM组比，DPN组的SOD、GSH-PX和E2F6蛋白水平较低，MDA水平较高（P＜0.05），见表2、图1。

表2 各组氧化应激指标及E2F6蛋白比较

图1 各组皮肤的E2F6蛋白比较

3 讨论

由于长期未控制高血糖，引发微循环改变、神经营养因子缺乏、自身免疫异常和过量氧化自由基产生等因素而导致DPN[5]。DM患者产生大量的活性氧簇，激活应激反应元件细胞凋亡通路，并抑制细胞色素氧化酶，影响葡萄糖代谢[6]。研究表明[7]，醛糖还原酶抑制剂可减轻氧化应激，改善DPN。

核转录因子E2Fs家族可调控细胞有丝分裂，并结合一系列下游基因启动子，与细胞增殖分化、凋亡等重要生命活动有关[8]。E2F6是E2Fs家族的一员，其可抑制DNA损伤诱导的细胞凋亡作用。相关研究显示，缺氧条件下，E2F6 mRNA和/或蛋白表达降低[9]。但E2F6在DPN的表达尚未见报道。在本研究中，对照组、无病变DM组、DPN组皮肤的E2F6阳性率分别为62.50%、46.25%和30.00%，呈递减趋势，提示E2F6表达下调使下游基因受到影响，引起细胞周期调控异常。在本研究中，与对照组比，DM患者外周血的SOD和GSH-PX水平较低，MDA水平较高；与无病变DM组比，DPN组外周血SOD和GSH-PX水平较低，MDA水平较高，提示DPN患者的机体氧化应激反应增强。DM患者的氧化应激反应增强，E2F6蛋白水平降低，引起微循环障碍，造成神经营养失调，从而导致DM神经损伤，继而出现典型神经病变症状[10]。因此，皮肤组织的E2F6和外周血的SOD、GSH-PX和MDA水平有助于判断DPN患者的病情。但皮肤组织E2F6蛋白检测具有侵入性，较难推广，关于皮肤组织E2F6蛋白与DPN的机制仍需进一步研究。