接骨木概况及遗传多样性研究进展

郭宇兰，刘克武，宗宪春

(1.黑龙江省林副特产研究所，黑龙江牡丹江157011；2.牡丹江师范学院生命科学与技术学院，黑龙江牡丹江157012)

1 接骨木概况

接骨木(SambucuswillamsiiHance)忍冬科(Caprifoliaceae)接骨木属(Sambucus),落叶灌木或小乔木[1]，广泛分布于中国、加拿大、西伯利亚等地区。接骨木资源丰富，约20种，中国有5～6种[2]，主要分布于中国东北地区。接骨木通常株高5～6 m；生于山坡、灌丛、路边等[3]。老枝呈淡红褐色，具明显的长椭圆形皮孔，枝上具纵棱线，茎髓发达，髓部淡褐色。接骨木的花与叶同出，圆锥形聚伞花序顶生，长5～11cm，宽4～14cm，具总花梗，花序分枝多成直角开展，有时被稀疏短柔毛，随即光滑无毛；花冠蕾时带粉红色，开后白色或淡黄色，萼筒杯状，长约1mm；雄蕊5枚与花冠裂片等长，开展，花丝基部稍肥大，花药黄色；雌蕊1枚，花柱较短或几无，柱头2～3裂，子房3～5室。浆果，果实红色，极少蓝紫黑色，卵圆形或近圆形，直径3～5mm，具宿存花萼；有2～3核，每核1粒种子，卵圆形至椭圆形，长2.5～3.5mm，略有皱纹。花期一般为4～5月，8月末，果落尽；11月初，叶落尽[4]。

接骨木在世界范围内分布极广，适应性较强，对气候要求不严；喜向阳，但又能稍耐荫。以肥沃、疏松的土壤培养为好。较耐寒，又耐旱，根系发达，萌蘖性强，容易引种和栽培，耐瘠薄，在岩石缝中亦能生存[5]。生长迅速，长势强健，抗病虫能力强，抗逆性强。根肉质，常有横生的根茎串生成新的植株，因而多为丛生状，根系发达，极具扩张能力[6]。

作为中医的传统药材，中医学上接骨木被制成膏药、蜜丸、胶囊等剂型而广泛应用于治疗骨折、跌打损伤[7](在中国，已有几个世纪用接骨木的茎枝治疗骨折的历史[8])、风湿性关节炎、痛风、大骨节病、慢性肾炎等。通过研究发现接骨木提取物可以增加骨密度、增强骨强度，在骨折愈合的所有时间点通过促进骨形成显著加速骨折愈合。其主要作用机制为通过骨折部位的骨密度、血清碱性磷酸酶和骨钙素水平，以及骨髓基质细胞中钙化结节数量来促进骨折愈合[9]。有报道称，接骨木提取物通过抑制骨再吸收过程和刺激骨再形成过程来改进骨性质[10]。据《本草纲目》中记载其释名为续骨木、木蒴。其味甘、苦，性平，无毒，有接骨续筋、活血止痛、祛风利湿的功能，多外用于治疗创伤出血[11]，同时还具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗氧化、抗艾滋病等药理功效[12]。近年的药理研究表明，接骨木具有降低血脂、延缓衰老、强健大脑等作用，是一种较理想的保健药物[13]。接骨木提取物还可以应用于化妆品中，有滋润皮肤的美容作用，如接骨木洗面奶、接骨木洗发香波、接骨木营养蜜、接骨木营养霜；接骨木苷和黏液质等成分有杀菌、消炎、止痒功能，可用于制作日常洗护用品[14]。

2 接骨木研究进展

2.1 接骨木的化学成分

接骨木含有复杂的化学成分和多种活性物质[15]。许多学者对接骨木的化学成分进行了研究，并取得了一定的进展。接骨木中含有丰富的黄酮类及黄酮苷类、木脂素、酚酸以及三萜类等化学成分。黄酮类及黄酮苷类又称黄碱素类，是许多中草药的有效成分，类型最全、结构最复杂、含量最高的黄酮类化合物集中分布在被子植物中[16]。

黄酮类及黄酮苷类具有防治骨质疏松、心血管疾病、清除自由基等药理功效[17]。林晓影等[18]从接骨木果实中提取得到的芹黄素、4，5，7-三羟黄酮醇、五羟黄酮、毛地黄黄酮、花青素等黄酮类化合物，对中老年妇女的代谢具有积极影响，可以防治骨质疏松等疾病。Lamaison等[19]从接骨木叶中分离到的人参黄酮苷(panasenoside)能显著降低实验动物的血压。李安林等[20]从接骨木茎中提取总黄酮溶液，然后加入二苯代苦味肼基自由基，结果表明总黄酮浓度越高清除自由基的效果越好。

木脂素类是由苯丙烷类氧化聚合而成的天然产物。欧阳富[21]用60%的乙醇从接骨木的茎枝中分离到7个木脂素类化合物；Choi[22]用甲醇从接骨木树皮中分离得到(-)-olivil-9-O- D-glucopyranoside木脂素类化合物；Hwang[23]用甲醇从接骨木茎枝中分离到木脂素类化合物lariciresinol，其生物活性表现为抗病毒、杀虫、抗肿瘤、保肝与抗氧化、平滑肌解痉、影响中枢神经系统以及抑制CAMP磷酸二酯酶等作用。此外，在接骨木中发现的8-O-4'去甲木脂素能够促进成骨细胞的合成代谢。当在细胞中加入雌激素受体颉抗剂或分裂原活化抑制剂后8-O-4'去甲木脂素对成骨细胞的合成代谢则失去了促进作用。在接骨木中发现的(+)-皮树脂醇，经试验观察发现其具有潜在的抗真菌作用，对白色念珠菌中的活性氧簇积累有诱导作用。

酚酸类成分是广泛分布于药用植物体内重要的次生代谢产物。杨序娟用60%的乙醇从接骨木茎枝中分离到vanillin， acetovanilone，coniferyl aldhyde，syring aldehyde，4-hydroxybenzoic acid，4-hydroxycinnamic acid，protocatechμic acid，vanillic acid，ferulic acid，indole-3-carboxylic acid等十个酚酸类化合物。研究表明该类化合物是一种良好的抗氧化剂，具有收敛、抗菌消炎、止血、抗肿瘤、抗突变、抗脂质过氧化物、抗病毒等多种生物活性[24]。

接骨木的茎枝中含有多样化的生理活性的三萜类化合物。杨序娟等[25]从接骨木茎枝的体积分数为60%的乙醇提取物中分离到白桦醇、白桦酸、齐墩果酸、熊果酸和α-香树脂醇5个三萜类化合物，其中对抗肝炎活性最为明显的是齐墩果酸。郭学敏[26]等从接骨木茎枝的乙醇提取物中也分离到了有较好的抗肝炎活性的三种三萜类化合物，即ursolic acid, cramyrin, lupeol palmitate。

2.2 接骨木籽油的研究现状

接骨木是珍稀的野生木本油料植物。接骨木的种子含有35%～44%的油脂，油脂中ɑ-亚麻酸的含量较高[27]。此外，接骨木籽油中n-3和n-6系列脂肪酸的配比较合理，该合理配制有益于生命质量的提高[28]，故开发接骨木籽油资源拥有一定的经济和社会效益。

2.2.1 接骨木籽油的理化指标

接骨木籽油为橙黄色，无杂质，清澈透明，具有浓郁的油香味。有学者采用阿贝氏折光计测得其折光率是1.4617；采用自动旋光仪测得其旋光度是0.152(L)；采用比重瓶法测得其比重是0.88 kg/L；采用韦氏法测得其碘价是122.72 g/100g；采用皂化瓶法测得其皂化价是178.45mg/g[29]。日常食用的大豆油的比重是0.92 kg/L，碘价是119 g/100g，对比后可知接骨木籽油的比重小于大豆油，碘价大于大豆油，说明接骨木籽油的不饱合脂肪酸含量较高，其有益于人体健康。

2.2.2 接骨木籽油中的重金属含量

表1 接骨木籽油的重金属含量

据文献报道，有学者[30]采用原子吸收光谱法测定了接骨木籽油的重金属含量，结果如表1所示：

由表1可知，接骨木籽油的重金属含量均低于国家标准，其重金属含量未超标，在安全范围之内无害。

2.2.3 接骨木籽油的脂肪酸组成及含量

有研究者通过气相-质谱联用仪，采用峰面积归一化的方法定量分析了籽油的脂肪酸含量。结果表明接骨木籽油的棕榈酸含量大约为15.43%，硬脂酸含量大约为1.60%，油酸含量大约为28.74%，亚油酸含量大约为30.79%，ɑ-亚麻酸含量大约为22.49%[31]。在脂肪酸种类及含量方面，将接骨木籽油与常见食用油对比可知，接骨木籽油的ɑ-亚麻酸含量明显高于对比食用油，这表明接骨木籽油富含人体必需脂肪酸，其保健功效显著[32]。

2.2.4 接骨木籽油的生物活性

胡荣等[33]研究者以鸡和小鼠作为研究对象，在2周内给它们灌胃接骨木籽油，剂量是4g/kg。研究结果表明，接骨木籽油明显降低了高脂动物模型的血清总胆固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白，增加了它们的高密度脂蛋白以及高密度脂蛋白与总胆固醇的比值。该实验结果说明接骨木籽油具有降血脂的作用。

李炫万等[34]研究者以小鼠为研究对象，每日定时给小鼠灌胃一次接骨木籽油，剂量为2000mg/ kg。结果表明，小鼠的S180荷瘤实体瘤以及H22肝癌实体瘤被抑制生长。该实验结果显示接骨木籽油具有抗癌的活性。

Zakay-Rones等[35]研究者以流感患者为研究对象，实验过程让他们口服接骨木籽油。结果发现流感在3天内就能完全被治愈的患者占90%。学者认为接骨木籽油减少了人体内红细胞的凝集作用，抑制了流感病毒的复制。学者Barak[34]在一系列体外实验中发现接骨木籽油可以有效抑制10种流感病毒的生长。此外，Yesilada等[36]研究者通过一些列实验总结出矮接骨木籽油在1.95～250g/ L浓度范围下可以有效抵抗幽门螺旋杆菌。

刘铮等[37]研究者以小鼠为研究对象，进行了常压耐缺氧的实验。实验过程中给小鼠进行腹腔注射以给药接骨木籽油，剂量分别为10、20、40mL/kg。实验结果表明，体内被注射了籽油的小鼠的存活时间明显高于与空白对照组(注射同等剂量的蒸馏水)，且籽油的剂量越大，实验小鼠的存活时间就越长。

范妮娜等[38]研究者以小鼠为研究对象，给它们灌胃接骨木籽油，剂量为12.5 mg/ kg。结果表明，接骨木籽油可以强烈刺激小鼠体内淋巴细胞的转化，恢复被环磷酰胺抑制的淋巴细胞的转化，效果明显优于对照组，该实验显示接骨木籽油可以活化淋巴细胞，其具有免疫活性。

Mlinaric等[39]研究者发现，在接骨木籽油的IC50值为0.017g/L的时候，它会抑制HIV- 1逆转录酶，这说明该籽油具有抗艾滋病的作用。Zakay-Rones等[39]研究者通过实验发现接骨木籽油可以有效抑制CD+细胞和淋巴细胞中的HIV病毒感染，将这些细胞从病人的血液中分离出来后与接骨木籽油置于一处培养一段时间后，在体系中检测不到HIV抗原，这说明该籽油具有抗艾滋病的作用。

接骨木籽油的用途广泛，是一种功能性的油脂，其发展前景广阔。随着人们逐步认识到接骨木籽油的生物活性功能以及人们对籽油提取工艺的不断优化和改进，接骨木籽油的大规模生产和开发利用必然会得到有效的落实。

3 遗传多样性研究

3.1 生物多样性与遗传多样性

生物多样性是指一定空间范围内生物及其组成系统的总体多样性和变异性[40]。生物多样性通常包括3个主要层次，即基因多样性、物种多样性和生态系统多样性[41]。

生物多样性的重要组成部分是遗传多样性[42]。广义上讲，遗传多样性是指地球上生物所携带的所有遗传信息的总和。这些遗传信息储存在生物个体的基因之中，因此，生物多样性也就是生物的遗传基因的多样性，是生命进化和物种进化的基础。狭义的遗传多样性则是指生物种内不同种群间以及个体间的遗传多态性程度。但基因(或遗传)多样性远远超过了物种多样性的范畴[43]。

遗传多样性是利用遗传标记来进行研究[44]。遗传标记是指可以稳定遗传的易于识别的特殊的遗传多态性形式[45]。遗传多样性的研究方法主要有四种，即形态标记(Morphological Markers)、细胞标记(Cytological Markers)、生化标记(Biochemical Markers)和分子标记(Molecular Markers)[46]。

形态标记是指显示植物遗传多态性的外观性状。该方法具有快捷、方便的优点。但由于一些形态标记的多态性差，易受环境因素的影响，且标记的性状数量有限，人工培育形态标记材料的周期较长，准确性不高[47]。

细胞标记主要是通过染色体的数目和结构变异来显示。染色体的数目特征指的是经过特殊染色显带后的染色体带的颜色深浅、宽窄和位置顺序等；而染色结构变异如缺失、重复、倒位和易位等，非整倍体变异如缺体、单体、三体等都各有其特定的细胞学特征[48]。由于用细胞学方法难以检测不涉及染色体数目、结构变异或带型变异的性状，且该标记材料的选育需要花费大量的时间和人力，因此难以广泛应用[49]。

生化标记是指利用基因的表达产物，主要包括贮藏蛋白、同工酶和等位酶等。具有经济方便、不易受环境影响的特点[50]。但用该方法标记的数量不能满足实际的需要，存在组织特异性和器官特异性。

分子标记广义是指在分子水平上可标识的基因组中任何位点上的相对差异，狭义是指以DNA多态性为基础的遗传标记[51]。与形态学标记、生物化学标记和细胞学标记相比，因其数量多(理论上遍及整个基因组)、多态性高、多数标记表现为共显性等特点[52]，目前已在构建遗传图谱、亲缘关系分析、遗传多样性分析、分子标记辅助育种等方面得到了广泛地应用[53]。

根据检测方式可将其分为三类：(1)以DNA-DNA杂交为基础的分子标记，如比较经典的RFLP分子标记[54]；(2)以基因组测序为基础的DNA分子标记，如SNP(单核苷酸多态性)分子标记[55]；(3)以PCR技术为核心的DNA标记技术，如RAPD(随机扩增多态性DNA技术)分子标记、SSR分子标记、AFLP(扩增片段长度多态性)分子标记[56]等。

3.2 AFLP分子标记

AFLP(Amplified fragment length polymorphism)是由荷兰Keygene公司科学家Vos和Zabeau在RFLP和RAPD分子标记技术的基础上发展起来的一种检测DNA多态性的技术[57]。其基本原理是首先利用限制性内切酶水解基因组 DNA ，使其产生不同大小的 DNA 片段，然后与双链人工接头的酶切片段相连接作为扩增反应的模板，再以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加 1～3个选择性核苷酸作引物，对模板 DNA进行选择性扩增[58]。为了能对扩增片段的大小进行调节，一般采用两个限制性内切酶，一个是切点多的酶，如MseI-具有4碱基识别位点；另一个是切点较少的酶，如Eco RI-具有6碱基识别位点。随后将双链人工接头连接在酶切片段两端形成带接头的特异片段，然后通过PCR引物与接头序列结合，经变性、退火和延伸周期性的循环后被扩增，再通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性[59]。

AFLP标记具有分辨率高、稳定性好、效率高、多态性强的特点，而且一次可检测到100～150个扩增产物，因而是进行种质遗传多样性和亲缘关系分析的有效方法，可以确定个体间的遗传差异和亲缘关系，从而确定其遗传距离进而进行品种指纹图谱绘制及分类研究[60]。