豆粉中大豆转基因成分检测能力验证项目检验方法分析

□ 刘彦泓 杨 滴 大连市检验检测认证技术服务中心

能力验证已经成为实验室质量控制的常用方法之一，其在确定实验室检测或校准能力方面具有不可替代的作用。中国合格评定国家认可委员会（CNAS）要求已认可的实验室和申请认可的实验室必须参加能力验证活动。转基因抗草甘膦除草剂（Roundup Ready® ）大豆（即转基因大豆GTS-40-3-2）是目前种植面积和产量都很高的转基因作物，实验室开展此项目的检测能力验证，既可以提高实验室的检测技术能力与水平，也有利于提高实验室对转基因大豆进行监管的能力。

1 材料与试剂

1.1 试验样品

转基因大豆GTS40-3-2样品：中检院NIFDC-PT-136豆粉中大豆转基因成分测定能力验证阳性样品。

1.2 主要试剂

DNA提取试剂盒（Magnetic DNA Purif ication System For Food），购自Promega公司；PCR反应试剂盒TaKaRa Ex Taq® DNA Polymerase、Premix Ex Taq ™ （Probe qPCR），购自Takara Bio公司。

1.3 引物及探针序列

引物及探针购自Takara Bio公司，引物及探针序列见SN/T1195-2003[1]和GB/T19495.5-2018[2]。

2 方法

2.1 模板DNA的提取

采用Promega公司Magnetic DNA Purif ication System For Food试剂盒说明书进行提取。

2.2 PCR检测

Ex Taq 0.25 μL，10×Ex Taq Buf fer 5 μL，dNTP 4 μL，引物（10 μmol/L）各 1 μL，DNA（50 ng/μL）2 μL， 补水至50 μL。PCR扩增条件：94 ℃下5 min；94 ℃下 30 s，54 ℃下 40 s，72 ℃下60 s，40个循环；最后一次循环中，72 ℃下7 min。扩增结束后，对产物进行电泳，并记录结果。

2.3 实时荧光PCR检测

反应缓冲液10 μL，引物（10 μmol/L）各 1 μL， 探 针（10 μmol/L）1 μL，DNA（50 ng/μL）1 μL， 补 水 至 20 μL。扩增条件95 ℃保持10 min；95℃保持1 min，60 ℃保持30 s（读取荧光），40个循环。扩增结束后，对产物进行电泳，并记录结果。

2.4 实验设置

每个PCR反应均设置2个平行实验，并设置空白对照、阳性对照和阴性对照。

3 主要仪器

ABI实时荧光PCR仪（型号为QuantStudio 7Flex），购自赛默飞世尔科技有限公司；ABI PCR仪（型号为VERITI），购自赛默飞世尔科技有限公司。

4 结果及分析

4.1 PCR检测结果

内源基因Lectin与外源基因CaMV35S、NOS、CP4 EPSPS的检测结果均为阳性，其PCR产物大小与预期大小基本一致，空白对照、阳性对照和阴性对照均符合要求，判定此样品为转基因大豆GTS40-3-2阳性。电泳结果见图1。

图1 PCR检测结果

4.2 实时荧光PCR检测结果

内源基因Lectin和GTS40-3-2品系特异基因检测结果均为阳性，空白对照、阳性对照和阴性对照均符合要求，判定此样品为转基因大豆GTS40-3-2阳性。扩增图见图2。

5 结论与讨论

笔者所在实验室作为中检院NIFDC-PT-136豆粉中大豆转基因成分测定项目的技术合作实验室，在样品制备、样品转基因成分定性检验、样品均匀性及稳定性检验等基础性研究上做了大量的工作。对于转基因大豆能力验证样品的检验，总结出几点需要注意的地方。

图2 实时荧光PCR检测结果

5.1 避免污染

能力验证发放的样品一般为阴性和阳性样品均有。由于样品是经过粉碎过筛的大豆粉，其粉尘容易飘散，取样过程不规范可造成不同样品之间的污染。目前转基因成分检测方法中，PCR检测方法的应用最为广泛[3]。PCR检测的优点是灵敏度高、操作简便、快捷；缺点是操作不当容易造成污染，产生假阳性结果。PCR扩增时最主要的污染源是扩增产物，PCR扩增的终产物容易飞溅或形成气溶胶，对实验室环境、试剂、设备和衣物等造成污染[4]。因此检测过程中避免污染非常重要。为保证结果准确，参加测试的实验室应该在实验室区域划分、检测过程质量控制等方面遵循规范性标准要求。核酸检测实验室应划为5个区：试剂配制和贮存区、样品制备区、PCR反应配制区、扩增区和扩增产物分析区。做好清洁消毒工作：定期对实验室进行消毒，用75%的酒精擦拭移液器等小型设备；经常擦洗台面、地面，做好卫生工作；加强实验室空气与大气空气的置换，从而净化实验室空气；经常对实验室进行长时间紫外灯照射，灭活空气中的游离核酸片段。另外在实验过程中应按标准要求设置阳性对照、阴性对照和空白对照，反映检测过程是否存在污染。

5.2 模板DNA浓度和纯度

模板的浓度和纯度对目的基因的检测来说是较为重要的[5]。通过紫外分光光度计可以测定模板DNA的浓度，并计算A260nm/A280nm的比值，在1.7～2.0比较好。通常情况下，建议PCR反应体系中模板的添加量为50～100 ng。

5.3 检测方法的选取

目前现行有效的涉及转基因大豆检测方法的标准有很多：GB/T 19495.4-2018、SN/T 1195-2003、SN/T 1204-2016、SN/T 2668-2010、SN/T 1202-2010、NY/T 675-2003 及SN/T 1201-2014等。建议实验室选择本实验室常用的检验方法进行检验。同时建议选择两种以上的方法进行比较后，得出结论。