高效液相色谱-串联质谱法测定火锅底料中的罗丹明B

□ 陈瑞莲 佛山市食品药品检验检测中心

罗丹明B又名玫瑰红B或碱性玫瑰精，俗称花粉红，是一种鲜桃红色的人工合成碱性荧光染料[1]，常用于有色玻璃、矿业和钢铁等行业[2]。由于罗丹明类染料具有潜在的致癌和致突变性，中国卫生部已经将罗丹明B列于《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第一批）》中[3]，但由于罗丹明B着色效果好，色泽鲜亮，被一些不法商家应用于辣椒及其制品和调味酱等的染色[4]。因此，对罗丹明B的快速检测方法进行研究及其重要。目前，常用于罗丹明B检测的前处理方法主要有凝胶色谱净化法[5]、直接提取法[6]、固相萃取柱净化法[7]等，本文采用C18固相萃取小柱净化，超高效液相色谱-串联质谱法对罗丹明B进行测定，结果显示，该法溶剂消耗量少，稳定性和重现性均满足实验要求，适合于火锅底料中罗丹明B的检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗丹明B购自德国Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、甲酸（均为色谱纯），购自德国默克公司；C18固相萃取小柱（3 mL，500 mg），使用前依次用5 mL甲醇、5 mL水活化。

1.2 仪器与设备

Quattro Premier XE三重四级杆质谱仪（配有Acquity UPLC超高效液相色谱仪及电喷雾离子源）美国Waters公司；固相萃取装置；电子天平；涡旋振荡器；旋转蒸发仪；离心机。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

准确称取适量罗丹明B标准品，用甲醇配制成浓度为100 μg/mL的标准储备液，用初始流动相将标准储备液稀释成1.0、2.0、5.0、25.0 ng/mL及50.0 ng/mL的标准工作液。

1.3.2 样品的提取

称取2.0 g火锅底料于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈∶1%乙酸水=6∶1的溶液进行提取，涡旋1 min后置于超声波清洗机中超声20 min，期间振摇一次。超声结束后于8 000 r/min离心10 min，上清液过滤后待净化。

1.3.3 样品的净化

将上述过滤液全部转移至活化后的C18固相萃取小柱中，待其自然流尽后，依次用3 mL水、3 mL甲醇-水（1∶1）洗涤，最后用5 mL氨水-甲醇（1∶9）洗脱，收集全部洗脱液，流速不超过1 mL/min。将洗脱液在50 ℃下氮气吹干，用初始流动相定容至1 mL，涡旋混匀后，经0.22 μm滤膜过滤后，用UPLC-MS/MS测定。

1.3.4 超高效液相色谱-串联质谱条件

色 谱 柱：Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。柱温35 ℃；流动相：A相为乙腈，B相为0.05%甲酸水溶液。梯度洗脱程序：0～0.01 min，40%A；0.01～1.00 min，40%～70%A；1.00～2.00 min，70%～90%A；2.00～3.00 min，90% ～ 90%A；3.00～ 3.01 min，90%～40%A；3.01～6.00 min，40%A。流速：0.3 mL/min；进样量5 μL。

质谱条件：采用电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测扫描模式；毛细管电压3.0 kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度350 ℃；脱溶剂气流量700 L/min。

表1 罗丹明B保留时间及质谱参数表

2 结果与分析

2.1 质谱条件的选择

取浓度为300 ng/mL的罗丹明B标准溶液，通过注射泵与适当流速的流动相共同进入质谱仪，主要对离子源参数中的毛细管电压、锥孔电压、脱溶剂气温度、脱溶剂气流速以及碰撞能量等参数进行优化，在最佳质谱参数下（见表1），得到罗丹明B的MRM图，见图1。

2.2 色谱条件的选择

罗丹明B可溶于水、丙酮、乙腈等溶剂，对于质谱常用流动相甲醇和乙腈，乙腈的洗脱效果高于甲醇，因此选择乙腈-水作为流动相，加入0.05%甲酸促进罗丹明B的电离。

图1 罗丹明B的MRM图

图2 罗丹明B的标准曲线

表2 回归方程及相关系数表

表3 回收率及精密度

2.3 市售火锅底料中罗丹明B的检测结果

本研究按照上述方法，测定了市售的12种火锅底料（多油型或少油型），均未检出罗丹明B，也从一定程度上说明，目前本地区的火锅底料食品暂无违法添加罗丹明的情况。

2.4 方法学验证

2.4.1 标准曲线

将1.3.1方法中配制的标准溶液上机测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线（见图2），并计算出相关系数（r），结果见表2。由实验结果可知，回归方程相关系数r大于0.999 9，线性关系良好。

2.4.2 回收率和精密度

在3个火锅底料样品中分别加入低、中、高浓度的待测物，每个浓度做6个平行试验，计算加标回收率和相对标准偏差，实验结果见表3。由实验结果可知，回收率在90.3%～97.0%，相对标准偏差在5.1%～9.3%，回收率高，重现性好，具有较高的准确性和可靠性，能满足定量检测的要求。

3 结论

本文采用乙腈+1%乙酸水做为火锅底料的提取液，经过C18固相萃取柱净化后，经过BEH C18柱，以乙腈和0.05%甲酸水为流动相进行梯度洗脱，正离子扫描，多反应监测模式下进行定性定量分析罗丹明B的含量，该法比SN/T 2430-2010《进出口食品中罗丹明B的检测方法》简单快捷，净化不需要用凝胶色谱净化系统，节省了溶剂和时间，且回收率高，重现性好，可作为火锅底料中罗丹明B的快速检测方法。