线粒体转运RNA基因突变与原发性高血压的相关研究

孙艳梅，张玉霄，卢才义，李泱*

(1解放军总医院第一医学中心心血管内科，北京 100853；2赤峰松山医院心血管内科，赤峰 024000)

原发性高血压(essential hypertension,EH)受多种环境因素和遗传因素的共同影响，其中遗传因素占30%～60%。然而，全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)表明核基因突变不能很好地解释EH的发病机制。诸多研究者显示，心血管疾病与具有母系遗传模式的线粒体基因(mitochondrial DNA,mtDNA)突变密切相关，而EH患者表现为典型的母系遗传特点[1,2]，因此认为EH可能与mtDNA突变有关。目前发现与高血压发病相关的线粒体转运RNA(transfer RNA,tRNA)对应的基因突变分别为线粒体tRNAIle、tRNAMet、tRNAGln和tRNAMet/tRNAGln突变等，提示线粒体tRNA的基因突变可能在EH发病过程中起着重要的作用[3-6]。突变对tRNA转录修饰及其蛋白翻译等功能(如tRNA代谢水平、蛋白质翻译水平、呼吸链功能及氧耗率等)产生影响，从而影响线粒体功能，进一步改变血管内皮细胞和平滑肌细胞的功能，导致细胞的增殖与凋亡失调，血管重构，收缩功能异常，引起血压的改变。尽管有较多研究已表明mtDNA突变可引起血压的改变[7-11]，但这些研究的患者多来自散在家系。本研究依照EH的发病特点，结合母系遗传特征，对多个家系的EH患者采用全mtDNA测序的模式，探讨线粒体tRNA的基因突变与EH特别是具有母系遗传特征的EH间关系，以期为临床及早诊断并预防EH提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2015年1月至2018年12月解放军总医院心血管内科收治的EH患者82例，根据母系遗传判别标准，分为母系遗传EH组(A组，n=17)和非母系遗传EH组(B组，n=65)。另选取同期来本院进行健康体检的健康人群作为对照组(C组，n=33)。受试者均为汉族。EH判断标准：既往明确诊断为EH，目前服药治疗血压维持正常或≥140/90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)；或者既往无高血压病史，门诊不同日随访2次平均收缩压≥140 mmHg或平均舒张压≥90 mmHg(间隔24 h)。母系遗传EH判别标准：参考以往研究者母系遗传高血压家系的标准，2代母系成员中都有EH患者，且至少有一代有2例以上(含2例)同代母系成员明确诊断为EH[12]。为了减少非母系遗传EH对实验的影响，还增加2个条件，一为三代母系成员均有EH患者；二为非母系成员EH者不能超过1例。非母系遗传判别标准：除本人为EH患者外，三代母系成员内无任何1名明确诊断为EH。健康对照组标准：包括本人在内的三代所有家系成员中均无EH。排除标准：(1)继发于肾脏病、内分泌疾病、血管病变、颅脑病变及其他疾病的继发性高血压；(2)伴有严重的心力衰竭、心肌病、风心病、先天性心脏病；(3)明确诊断为其他线粒体病，如线粒体脑病乳酸性酸中毒伴卒中样发作、母系遗传性心肌病、Leber′s眼病、肌阵挛癫痫伴肌肉破碎红纤维综合征、慢性进行性眼外肌麻痹、帕金森病、老年痴呆症、母系遗传性耳聋、氨基糖苷诱发的耳聋等；(4)恶性肿瘤或血液系统疾病(如严重贫血、再生障碍性贫血及淋巴瘤等)；(5)正在服用避孕药或已经妊娠或半年内准备妊娠的妇女；(6)有肝炎、HIV阳性、梅毒等传染病；(7)主管临床医师认为不适合参与该研究。本研究通过解放军总医院医学伦理委员会批准同意实施，所有志愿者均签署知情同意书。A及B组患者在确定符合纳入排除标准后预约时间抽血，对照组在体检时按照血生化和血常规检测取样的要求抽血。每位志愿者外周静脉抽血5 ml用以后期检测分析。

1.2 方法

1.2.1 全血样本DNA提取及检测 取新鲜抗凝外周静脉血3 ml，加到预先装入9 ml红细胞裂解液的15 ml离心管中，3 000转/min，离心10 min，吸弃上清，加1 ml蛋白沉淀液振荡25 s混匀。3 000转/min，离心10 min，取上清约3 ml置入另一只干净的15 ml离心管中，加入等体积异丙醇轻柔颠倒，出现棉絮状或丝状白色DNA沉淀。自然沉淀白色DNA后弃大部分上清，然后加入3 ml 70%乙醇，颠倒10次，3 000转/min，离心1 min, 弃上清，空气晾干沉淀5～10 min，加入DNA溶解液250 μl溶解DNA。采用超微量蛋白核酸分析仪(上海谱元仪器公司)检测DNA浓度(合格标准A260 nm/A280 nm>1.6)，并行电泳检测。

1.2.2 全mtDNA扩增及测序分析 在GenBank 中查询人全mtDNA序列，采用32对交叉重叠引物进行扩增。PCR扩增全长线粒体16.6 kb，DNA片段长度306～805 bp，平均594 bp，扩增的基因多于实际mtDNA长度约14.4%。纯化PCR产物，在自动测序仪上进行DNA测序，并用Mac VectorTM 7.0(Oxford Molecular Ltd, Oxford, England)软件对DNA测序，结果与线粒体基因文库MitoMap的修正剑桥序列进行比对分析。

1.3 统计学处理

应用SPSS 19.0软件对数据进行分析。多组间比较(均为满足正态分布的数据)应用方差分析。采用双向无序卡方检验及Scheffe多重比较法对线粒体tRNA基因突变率差异进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组受试者基线资料比较

3组受试者性别比较差异有统计学意义(P<0.05)，其他资料比较差异无统计学意义(P>0.05；表1)。

2.2 母系遗传EH占EH人群的比例

纳入人群中共有82例患者明确诊断为EH，其中母系遗传EH 17例，占20.7%，低于Yang等[12]报道的由线粒体效应引起的EH比例(35.2%)。

2.3 3组受试者线粒体tRNA基因总突变率比较

线粒体tRNA基因的碱基总数为1 504个，则A、B、C 3组受试者线粒体tRNA基因碱基总数分别为25 568、97 760和49 632个。对各组线粒体tRNA的基因突变分析显示，3组相应的总变异率依次为0.28%(74/25 568)、0.12%(126/97 760)及0.05%(24/49 632)。采用Scheffe多重比较法分析发现，A组(P=0.024)与B组(P=0.046)tRNA基因总变异率均明显高于C组，提示EH的发生确实与线粒体tRNA基因突变密切相关，但A与B组间比较差异无统计学意义(P=0.076)，考虑这可能与样本量小有关。

2.4 EH家系线粒体tRNA基因变异分析

为了明确母系遗传EH与mtDNA突变的关系，对A组的17个家系(A01～A17)线粒体tRNA基因突变分析，结果发现仅有1个线粒体tRNA基因位点突变的先证者有A06、A11和A13，其所在3个家系发生的突变依次为mtDNA A5823G、mtDNA T4386C与mtDNA C15910T。即mtDNA5823位于线粒体tRNACys基因相应位点的碱基A突变为G，mtDNA 4386位点tRNAGln基因对应碱基T突变为C，mtDNA 15910位点tRNAThr基因对应碱基C突变为T(表2)。A06号家系所调查的母系成员共13名，其中7例成员诊断为EH，占比53.8%(7/13)。A11号家系的母系成员8名，7例诊断为EH患者，占比87.5%(7/8)；A13号家系的母系成员12名，9例为EH患者，占比75.0%(9/12)，表明这3个家系中EH的发生具有典型的母系遗传特征，提示这3个位点的突变可能与EH发生密切关联。测序峰值曲线表明，以上突变在外周静脉血白细胞中均表现为单纯均质性突变体(图1)。

分析A组线粒体tRNA基因变异还发现，mtDNA 5597缺失在4个无任何血缘关系的家系中均出现。采用对比抽样人群线粒体tRNA基因碱基测序的方式，发现115位受试者中19名出现上述相同突变，其中A组4例(23.5%)，B组14例(21.5%)，C组1例(3.0%)。采用Scheffe多重比较法分析发现，A组与B组的mtDNA 5597缺失率差异无统计学意义(P=0.127)，A组与C组的发生率(P=0.002)和B组与C组的发生率(P=0.002)差异明显。提示mtDNA 5597缺失与EH的发生可能有关，但与母系遗传EH的发生无必然联系。对A01号的家系线粒体tRNA基因变异发现，A01号先证者有mtDNA 5597缺失，但其子虽诊断为EH却未发现mtDNA 5597的缺失，这也间接表明此位点突变与母系遗传EH无必然联系。

表1 3组受试者基线资料比较

A: matrilinear inheritance essential hypertension group; B: non-matrilinear inheritance essential hypertension group; C:control group. FBG: fasting blood glucose; LDL-C: low density lipoprotein cholesterol; TC: total cholesterol; TG: triglycerides.

表2 母系遗传EH家系的线粒体tRNA基因突变情况

·represents gene deletion.

图1 A06、A11及A13号家系先证者mtDNA序列分析(箭头示突变位点)

3 讨 论

目前全球高血压患病人数超过11.3亿人，其中EH占高血压人群的90%～95%，是世界上危害人类健康与生活质量的最重要疾病之一[13,14]。EH的发生发展受遗传因素和环境等多种因素的影响，虽然被研究多年，但发病机制仍不十分清楚[15-17]。既往EH遗传学的研究主要集中在核基因方面，但GWAS发现，核基因变异并未能成功揭示EH的发病原因[18]。近年来有研究发现，EH特别是具有母系遗传性质的EH发生与线粒体DNA突变有着较为密切的联系[6,19,20]。众所周知，线粒体是半自主细胞器，拥有自己的遗传物质和遗传体系。诚然，线粒体的代谢与生物功能受核基因和mtDNA共同调控，且目前发现与线粒体功能和遗传有关的基因大约有1 500个，但只有37个基因存在于mtDNA内。由于mtDNA自我修复系统较差，缺乏组蛋白保护，导致了mtDNA具有高突变率(是核基因的10～20倍)的特性[21,22]。我们的研究发现，非母系遗传EH组及母系遗传EH组线粒体tRNA基因发生的总突变率分别为0.12%和0.28%，远高于对照组的0.05%，提示EH的发生与线粒体tRNA基因突变存在密切的相关性，这可能与高血压人群中AngⅡ升高有关。AngⅡ能使细胞内ROS增多，损伤mtDNA。但0.12%与0.28%比较，差异无统计学意义，我们认为这和母系遗传组纳入人群例数较小有关。

为进一步明确母系遗传EH与mtDNA突变的关系，我们对具有母系遗传特征的EH家系进行分析，结果发现了3个家系仅有1个线粒体tRNA基因位点突变，分别为mtDNA A5823G、mtDNA T4386C和mtDNA C15910T。因为mtDNA是唯一表现为母系遗传的DNA，而3个家系的EH表现为典型的母系遗传，且这3个家系的线粒体tRNA基因就仅发现一个位点的突变，提示这3个位点突变体在母系遗传发生过程中可能发挥重要作用。值得注意的是，mtDNA 15910为线粒体tRNAThr基因D-loop臂的一个碱基，与15897位点G形成D-loop臂上的第一个碱基对C-G，但mtDNA15910突变为T后则不能形成碱基对，因此可能影响了线粒体tRNAThr的功能及稳定性。mtDNA C15910T在所对比的12个物种中，对应人类mtDNA 15910位点的碱基均为C，说明该位点具有高度的保守性，且携带mtDNA C15910T的家系母系成员表现为EH集中发病，表明mtDNA C15910T与EH的发生密切相关。此外，我们通过分析A01号家系及该位点在人群中的分布发现，mtDNA 5597位点基因缺失与EH的发生有一定的联系，但与母系遗传EH关系不大。我们认为可能的原因是mtDNA 5597本身具有基因多态性，而EH在病程进展中，因AngⅡ、ROS等作用可能进一步促使该位点发生缺失，导致EH人群和正常人群mtDNA 5597位点缺失率有较明显的差异。至于确切原因，尚待进一步研究揭示。

mtDNA突变导致的疾病表现为典型的母系遗传，然而并非所有线粒体病都表现为母系遗传。本研究显示，母系遗传对EH的影响为20.73%(17/82)，低于Framingham心脏研究的结果(35.2 %)[12]。这可能与两方面有关。一是样本量较小，本次研究仅为收集的小样本资料，而Framingham研究是关于1 593个家系；二是判定母系遗传影响的标准不尽一致，我们以三代母系成员中每代都有成员诊断为EH，且至少有一代超过2例母系成员为EH患者，非母系成员EH者不能超过1例。此种近乎苛刻的条件是为了尽量避免非母系遗传的影响，因此我们认为结果是合理的。

综上，线粒体tRNA基因的突变与具有母系遗传特征的EH发病有较好相关性，EH患者线粒体tRNA基因突变明显增多。mtDNA A5823G、mtDNA T4386C及mtDNA C15910T突变与母系遗传EH的发生可能更加密切，可能对母系遗传EH的发生产生重要作用。mtDNA 5597缺失可能促进EH的发生，但与母系遗传EH无必然联系。另外，我们还发现A15号家系同样携带mtDNA C15910T突变体，这就提示我们mtDNA C15910T对EH的影响较大，因此有必要作进一步研究深入分析A13及A15家系的所有母系成员。