高效液相色谱方法同时测定土壤中4种水溶性抗凝血杀鼠药

陈佩瑾 朱洋 冯萌萌 刘绿叶 彭庭辉

摘要 [目的]建立同时测定土壤中溴敌隆、杀鼠醚、杀鼠灵和敌鼠钠盐4种主要水溶性抗凝血杀鼠药的高效液相色谱检测方法。[方法]土壤中的4种鼠药经过乙腈与水混合溶剂超声波辅助萃取，过滤后用乙腈和0.01 mol/L乙酸铵缓冲溶液进行梯度洗脱，Zorbax Eclipse Plus C18柱分离，于波长306和265 nm处用紫外检测器检测，外标法定量。[结果]溴敌隆、杀鼠醚、杀鼠灵和敌鼠钠盐在0.1～100 μg/mL线性关系良好，方法检出限为0.1 mg/kg，方法的加标回收率为91.3%～103.1%，各物质相对标准偏差<2.5%。[结论]该方法的回收率与方法精密度良好，适用于土壤中溴敌隆、杀鼠醚、杀鼠灵和敌鼠钠盐的测定。

关键词 高效液相色谱法;超声提取;溴敌隆;杀鼠醚;杀鼠灵;敌鼠钠;土壤

中图分类号 X833文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）13-0179-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.055

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Simultaneous Determination of Four Watersoluble Anticoagulant Rodenticides in Soil by High Performance Liquid Chromatography

Abstract [Objective] The research aimed to establish a high performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of four major watersoluble anticoagulant rodenticides in the soil， such as bromadiolone， coumatetralyl， warfarin and diphacinoneNa.[Method]The four murine drugs in the soil were ultrasonically assisted extraction by acetonitrile and water mixed solvent.After filtration， the gradient was eluted with acetonitrile and 0.01 mol/L ammonium acetate buffer solution， separated by Zorbax Eclipse Plus C18 column， detected by ultraviolet detector at wavelengths of 306 and 265 nm， and quantified by external standard method.[Result]The calibration curve was linear in the range of 0.1-10.0 μg/mL， and the detection limit of the method was 0.10 mg/kg. The matrix recoveries was from 91.3% to 103.1%， and the relative standard deviations were less than 2.5%.[Conclusion]The method has good recovery rate and method precision， and is suitable for the determination of bromadiolone， coumatetralyl， warfarin and diphacinoneNa in soil.

Key words High performance liquid chromatography;Ultrasonic extraction; Bromadiolone;Coumatetralyl;Warfarin;DiphacinoneNa;Soil

作者简介 陈佩瑾（1969—），女，浙江奉化人，工程师，从事環境检测与检测质量管理工作。*通信作者，工程师，硕士，从事环境检测分析研究与管理工作。

收稿日期 2019-04-16

溴敌隆（bromadionlone）、杀鼠醚（coumatetralyl）、杀鼠灵（warfarin）和敌鼠钠盐（diphacinone-Na）是我国常用的几种水溶性抗凝血杀鼠药，因其灭鼠效果好、对人畜毒性低，近年来在我国得到认同并普遍使用。其中，杀鼠醚对防治林地中中华鼹鼠效果非常好，配合氯鼠酮等杀鼠药，林间杀鼠效果达到90%以上。随着此类杀鼠药的广泛使用，误服饵料现象常有发生，家畜、野生动物、人中毒情况也时有报道。抗凝血化合物会破坏维生素K循环，人或动物接触抗凝血杀鼠药后，可能会出现鼻出血、牙龈出血、尿液和粪便中带血、血管破裂引起淤伤和皮肤损害等中毒症状，造成该类鼠药中毒甚至死亡事件的增加[1-2]。同时对投放的杀鼠药管理不善，易对土壤及环境造成污染。该类老鼠药的生产企业较多，若管理不到位，也会造成生产区域及周边环境造成污染。因此，建立快速高效的土壤中溴敌隆、杀鼠醚、杀鼠灵和敌鼠钠盐的检测方法十分必要。

目前，国内外对于抗凝血杀鼠剂的分析测定主要采用紫外分光光度法、气相色谱法、薄层色谱法[3]、高效液相色谱法[4]、气相色谱-质谱法[5-7]、液相色谱-电喷雾质谱法（LC-ESI-MS）[8]、液相色谱串联质谱法（LC-MS-MS）[9]等。在这些检测方法中，紫外分光光度法检测灵敏度较差，抗干扰能力差;气相色谱法前处理耗时长，复杂的衍生化过程会对定量过程造成影响;高效液相色谱法可以准确检测μg/mL和μg/g浓度级别的样品，在抗凝血杀鼠药的检测中广泛应用，但色谱保留时间作为唯一定性指标缺乏足够的选择性，可能会导致假阳性结果。液相色谱质谱联用法（LC-MS）结合色谱分离与质谱结构确认的优点，无需耗时的衍生化过程，定性和定量分析的准确性与灵敏度都比其他方法高，但所用的仪器价格昂贵[10]。目前对于几种抗凝血鼠药同时测定的方法鲜见报道。笔者主要探讨高效液相色谱法分析土壤中的溴敌隆、杀鼠醚、杀鼠灵和敌鼠钠盐4种抗凝血杀鼠药。

1 材料与方法

1.1 标准品及试剂

溴敌隆、杀鼠醚、杀鼠灵标准溶液，浓度100 μg/mL，国家标准物质中心;敌鼠钠盐标准溶液，浓度1 000 μg/mL，国家标准物质中心;乙腈，液相色谱级，美国Thermofisher公司;乙酸铵，液相色谱级，国药集团化学试剂有限公司;超纯水，美国Millipore公司;其他未注明的试剂均为分析纯。

1.2 仪器设备

高效液相色谱仪，Thermo U3000，美国Thermo公司;紫外检测器;超声波清洗器，型号KQ5200DB，昆山超声机厂;样品有机过滤膜，0.45 μm。

1.3 标准溶液配制

分别移取溴敌隆、杀鼠醚、杀鼠灵和敌鼠钠盐标准溶液适量，配制成0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/mL的系列溶液，4 ℃避光保存。

1.4 样品前处理

准确称取土壤样品10.0 g，置于50 mL塑料瓶中，再准确加入10 mL一定比例的乙腈和水，放置于超声波清洗机中分2次超声提取，每次超声15 min。4 000 r/min离心5 min，过0.45 μm有机滤膜，待进样。

1.5 液相色谱条件

色谱柱：Zorbax Eclipse Plus C18，4.6 mm×250 mm×5.0 μm（美国Agilent公司）;流动相：乙腈和0.01 mol/L乙酸铵，梯度洗脱程序见表1;流速1.0 mL/min;柱温40 ℃;进样体积10.0 μL。

检测器参数设置：0～13 min采集波长306 nm，13～26 min采集波长265 nm，总采集时间26 min。

2 结果与分析

2.1 分析检测条件优化

2.1.1 色谱柱的优化。

该方法采用Hypersil Gold（4.6 mm×250 mm×5.0 μm）色谱柱分离，保留时间为7.4 min左右，杀鼠醚和杀鼠灵峰型重叠，判断为共流出，无法完全基线分离。经多次试验最终用Zorbax Eclipse Plus C18柱完成溴敌隆、杀鼠醚、杀鼠灵和敌鼠钠盐良好分离。标准溶液色谱图见图1。

2.1.2 不同溶剂比例萃取4种鼠药的回收率。

在土壤样品中分别加入相同质量浓度的溴敌隆、杀鼠醚、杀鼠灵和敌鼠钠盐标准溶液（100 μg/mL）100 μL，分别用不同比例的乙腈和水（乙腈∶水=70∶30、50∶50、30∶70）萃取，按照“1.5”色谱条件测定，计算回收率，结果见表2。结果表明，乙腈∶水=30∶70对4种鼠药的提取率较高，回收率较好。

2.2 标准曲线与检出限

取“1.3”配制的系列标准溶液，按“1.5”色谱条件测定峰面积Y与浓度X（μg/mL）进行线性回归分析，结果见表3。

将标准溶液通过高效液相色谱仪中的自动进样器量注入仪器中，计算7次平行测定的标准偏差，并计算方法的检出限，结果见表3。

2.3 回收率与精密度试验

取空白土壤样品（每份10.0 g），添加100 μg/mL 4种鼠药标准溶液100 μL，按照“15”色谱分析测定条件，分别测定7次，计算回收率及其相对标准偏差（RSD）。从表4可以看出，平均回收率为90%～105%，RSD为0.1%～1.5%。土壤理化性质（表5）与样品中4种杀鼠药的测定没有正相关性，其对该方法回收率影响不大，该方法稳定可靠。

2.4 样品定量分析

对某区域的3份土壤样品进行定量分析，并对有检出样品进行加标，排除假阳性结果。结果表明，

3 结论

该研究采用高效液相色谱紫外检测法对土壤中的杀鼠醚、杀鼠灵、敌鼠钠盐和溴敌隆进行同时测定。用乙腈和水的混合溶剂超声提取，以乙腈和0.01 mol/L乙酸铵梯度洗脱，Zorbax Eclipse Plus C18柱分离柱，在波长为306和265 nm处检测，实现了4种鼠药的分离和测定。该法快速方便准确，能满足土壤中溴敌隆、杀鼠醚、杀鼠灵和敌鼠钠盐同时测定的要求。

参考文献

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