蛹虫草多糖硫酸化修饰及抗氧化研究

李婧婧 李爽 刘静雪 李凤林

【摘要】采用醇沉法结合纤维素阴离子交换柱层析法获得蛹虫草中性精多糖级份（PCm）。采用氯磺酸-吡啶法对PCm进行硫酸化修饰改性得到硫酸化多糖（SPCm）。紫外光谱分析显示，SPCm在260nm附近有一个硫酸酯基特征吸收峰，说明已形成了硫酸化多糖。SPCm具有良好的抗氧化性，对DPPH自由基与超氧阴离子自由基均具有清除作用。

【关键词】蛹虫草 多糖 硫酸化修饰 抗氧化

1材料与方法

1.1材料与试剂

蛹虫草子实体，由吉林市汇丰科技公司提供;无水甲酰胺、氯磺酸、吡啶、氢氧化钠溶液、95%乙醇、苯酚、浓硫酸、氯化钡、明胶、咔唑、半胱氨酸、盐酸、葡萄糖、1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、DEAE-纤维素、氮蓝四唑（NBT）、还原型辅酶（NADH）、5-甲基吩嗪硫酸甲酯（PMS）、2，6-二叔丁基对甲苯酚（BHT）等均为国产分析纯。

1.2实验方法

1.2.1蛹虫草多糖的提取。将干蛹虫草进行粉碎，过60目筛，粉末按30：1料液比加入水，80℃提取2h、离心10 min，取上清液，沉淀再重复提取3次，，合并上清液并过滤滤液，用旋转蒸发器浓缩到原体积1/5，然后以4︰1（v/ v）的比例加入95%乙醇沉淀（4℃， 24 h）、离心，沉淀依次无水乙醇、丙酮洗涤，干燥后获得粗多糖组份。

1.2.2蛹虫草多糖的纯化。蛋白质的去除选择Sevag法。准确称取蛹虫草粗多糖0.5g，加蒸馏水溶解至100 mL，加入Sevag试剂摇匀反应12 min，离心除去蛋白层，反复多次，直至完全去除。滤液加入95%乙醇沉淀（4℃， 24 h），离心，沉淀用75%乙醇反复洗涤2次，获得去蛋白后粗多糖。向去除蛋白的粗多糖溶液中加入氨水，调pH=8.5，然后滴加H2O2，温度控制在40℃保温，混均后会看到溶液颜色发生变化，至橙黄色时，停止滴加氨水和H2O2，静置4h后，减压浓缩，醇析，真空干燥后保存备用。将脱色粗多糖溶于蒸馏水中制成5 mg/mL多糖溶液，上DEAE-纤维素柱，用蒸馏水按1.0 mL/min速度洗脱，每管，测每管（10 mL）多糖含量。将小峰去除，只收集最大峰，溶液经蒸馏水进透析袋透析48 h、干燥后得蛹虫草中性精多糖级份（polysaccharide from Cordyceps militaris，PCm）。

1.2.3硫酸酯化多糖的制备。将100mg PCm悬浮于10mL无水甲酰胺中，室温搅拌15min，随后加入2mL硫酸化试剂（氯磺酸和不同硫酸化反应溶剂混合，比例按1﹕4配比）。在连续搅拌下将混合物在室温下保持2h，然后在30℃保温5 h。迅速冷却至室温后，用15%NaOH溶液中和，透析，浓缩并干燥，得到硫酸化多糖（Sulfation polysaccharide from Cordyceps militaris，SPCm）。

1.3实验设计

1.3.1硫酸化反应的溶剂选择：为确定适合的反应溶剂，参考已知文献，以取代度为指标，选吡啶、DMF、甲酰胺、DMSO为酯化反应溶剂。

1.3.2紫外光谱分析：将PCm及SPCm加蒸馏水按1mg/mI浓度溶液，选取在190～400nm的波长进行紫外光谱分析，获得紫外光谱图。

1.3.3抗氧化能力确定：

（1）1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基清除能力。将SPCm溶解在蒸馏水中制成0.05、0.1、0.2、0.25mg/ml的溶液。用移液枪吸取1.0 mLSPCm加入2mL DPPH溶液（6.0mg DPPH溶解在100mL中甲醇），空白对照采用1.0 mL甲醇加入2mL DPPH溶液。缓慢摇晃使其混合均匀，室温条件下避光反应30 min，在517 nm处测定吸光度。以相同浓度的BHT溶液为对照，平行三次，取平均值。DPPH自由基的清除能力根据以下公式计算： 。式中：As-样品吸光度;A1 -空白对照的吸光度;A3-样品本底的吸光度。

（2）超氧阴离子自由基（02-·）清除能力。首先将SPCm溶解在蒸馏水中制成0.05、0.1、0.2、0.25mg/ml的溶液。采用NBT-NADH-PMS方法测定超氧阴离子自由基。样品管中依次加入1.0mL的NBT溶液（pH7.4），1.0mLNADH溶液（pH7.4）和0.1mL样品溶液，再加入100μL PMS溶液，室温反应5 min，在560nm处测定吸光度。以相同浓度的BHT溶液为对照，平行三次，取平均值。

DPPH自由基的清除能力根据以下公式计算： 。式中：A-样品吸光度;Ac -蒸馏水替代吸光度;A3-样品本底的吸光度。

1.4分析测定方法

采用苯酚-硫酸比色法测定多糖，采用氯化钡-明胶比浊法测定取代度，计算公式如下：取代度（DS）=1.62/（32-1.02）S×100。式中：S-样品中硫酸根质量分数（%）。

2结果与分析

2.1不同反应溶剂对蛹虫草硫酸化多糖取代度的影响

选择吡啶、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲酰胺和二甲基亚砜（DMSO）作为反应的溶剂，其对蛹虫草硫酸化多糖（SPCm）取代度的影响见图1。图1可以看出，以吡啶、DMF、甲酰胺、DMSO作为反应溶剂获得对蛹虫草硫酸化多糖的取代度依次为1.22、1.17、0.86、0.43。因此选择吡啶作为反应最佳溶剂。其原因可能DMF、甲酰胺、DMSO极性都比吡啶弱，所以硫酸化衍生物的取代度都不大。

2.2蛹虫草硫酸化多糖紫外光譜分析

蛹虫草硫酸化多糖（SPCm）的紫外光谱见图2，蛹虫草多糖（PCm）的紫外光谱见图3.图2、图3可以看出，SPCm与PCm在220nm附近均有多糖的特征吸收峰;SPCm在260nm附近有一个硫酸酯基特征吸收峰，说明已形成了硫酸化多糖。PCm在200-400nm间没有去硫酸酯基特征吸收峰。两者发生轻微位移不明显，说明多糖在硫酸化过程中基本没降解较。

2.3蛹虫草硫酸化多糖对DPPH自由基的清除作用

实验结果显示在0-0.2mg/mL剂量范围内，SPCm的DPPH自由基清除活性弱于BHT，但在不断增加的浓度下，RAP的清除作用迅速赶上并超过BHT。浓度为0.25mg/mL时，SPCm与BHT的清除活性为的86.89%和80.45%。即SPCm对DPPH自由基具有良好的清除活性。

2.4蛹虫草硫酸化多糖对超氧阴离子自由基的清除作用

通过实验结果发现SPCm和BHT的超氧阴离子自由基清除活性随着其浓度的增加而增加。在0.25mg/mL时，SPCm和BHT显示74.62%和83.35%的清除活性，BHT比SPCm更有效。 结果表明，SPCm对超氧阴离子自由基具有较高的清除活性，但低于BHT。

3结论

采用醇沉法结合纤维素阴离子交换柱层析法获得蛹虫草中性精多糖级份（PCm）。采用氯磺酸-吡啶法对PCm进行硫酸化修饰改性得到硫酸化多糖（SPCm），获得以下结果：

（1）吡啶作为反应溶剂获得对蛹虫草硫酸化多糖的取代度最高，是反应最佳溶剂。氯磺酸一吡啶法是多糖硫酸化最理想的一种方法。

（2）糖紫外光谱分析显示，SPCm在260nm附近有一个硫酸酯基特征吸收峰，说明已形成了硫酸化多糖。PCm在200-400nm间没有去硫酸酯基特征吸收峰。两者发生轻微位移不明显，说明多糖在硫酸化过程中基本没降解。

（3）SPCm对DPPH自由基具有良好的清除活性。

（4）SPCm对超氧阴离子自由基具有较高的清除活性，但低于BHT。

基金项目：1.吉林农业科技学院大学生科技创新创业计划项目《蛹虫草的多糖硫酸化修饰及抗氧化研究》[吉农院合字（2018）第040号]2.吉林省教育厅十三五科技项目《蛹虫草多糖硫酸化修饰及其生物活性研究》[JJKH20180732KJ]。

第一作者简介：李婧婧，女（汉），吉林人，吉林农业科技学院食品工程学院食品科学与工程专业2016级本科生。通讯作者：李凤林（1973-），男（汉），吉林人，研究方向：食品营养与分析。