保康鲊广椒中乳酸菌的分离鉴定及其发酵特性的评价

张逸舒，王玉荣，陈芸曼，张傲然，张振东，郭壮

（湖北文理学院食品科学技术学院鄂西北传统发酵食品研究所，湖北 襄阳 441053）

保康县位于秦巴山区深处，隶属湖北省襄阳市，西连神龙架，北交武当山，境内山峦重叠森林覆盖率达66.8%，生活着汉族、畲族、回族和土家族等多个民族[1]。特殊的地理环境及多民族杂居的现状赋予了其独特的饮食文化，保康地区居民历来有制作和食用鲊广椒、臭豇豆、臭豆渣和臭酱巴的习俗。保康地区鲊广椒以鲜红辣椒和苞谷面（玉米碜）为主要原料，采用厌氧发酵制作而成，具有酸辣可口和味道鲜香的特点，常作为辅料用于腊肉、鸡蛋和鱼类的烹饪中。传统发酵食品的风味品质与其微生物多样性息息相关，而发酵食品制作地的生态环境在很大程度上影响了其蕴含的微生物群系[2]。曾有研究对湖北当阳地区鲊广椒的微生物多样性进行解析，结果发现鲊广椒中的细菌主要以乳酸杆菌属（Lactobacillus）为主[3-4]。然而目前关于保康地区鲊广椒乳酸菌多样性研究的报道尚少。

作为现代食品加工业常用的发酵剂，乳酸菌广泛存在于泡菜[5]、发酵肉制品[6]、发酵乳制品[7]、发酵酒[8]和人体肠道[9]中，长期食用乳酸益生菌具有调节肠道菌群[10]和改善代谢综合症[11]的功效。鲊广椒的发酵原料为蔬菜和淀粉质食材，发酵方式为厌氧固态发酵，制作方法亦与酸奶、泡菜及腊肉制品均存在较大的差异，因而其乳酸菌群系可能存在一定的特殊性，所以在解析乳酸菌多样性的基础上开展菌株收集工作具有积极的意义。在实地调研过程中，本研究团队发现鲊广椒虽然广泛分布于我国云南、四川、重庆、湖北、湖南和贵州等华中和西南地区，但其产业化程度较低，多以百姓自制为主，且制作的鲊广椒产品风味品质相对较差，存在轻微臭味等产品缺陷问题。由此可见，积极开展具有优良发酵特性鲊广椒来源乳酸菌的筛选，以乳酸菌纯种发酵代替自然发酵，对鲊广椒风味品质和食用安全性的提升均具有积极意义。

本研究采用纯培养和16S rRNA 鉴定技术对7 份采集自保康地区的鲊广椒中乳酸菌多样性进行了解析，在对其乳酸菌分离株进行分离鉴定的基础上，采用电子鼻和电子舌从风味和滋味两个维度对具有优良发酵特性的菌株进行筛选，以期对后续鲊广椒风味品质的提升提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米碜和二荆条红辣椒：市购；石蕊牛乳培养基、MRS 培养基：青岛海博生物技术有限公司；氯化钠、碳酸钙、甘油、草酸铵结晶紫、碘、95 %乙醇、番红、过氧化氢、磷酸二氢钾、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、氯仿、异戊醇、十六烷基三甲基溴化铵（hexadecy1 trimethylammonium bromide，CTAB）（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；10×PCR Buffer、dNTP、Taq酶：北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖：西班牙Biowest 公司；27F、1495R 通用引物：武汉天一辉远有限公司；阴离子溶液、阳离子溶液：日本INSENT 公司；草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸：西陇科学股份有限公司。

1.2 仪器与设备

YL90-2 磨面机：上海捷朗机电有限公司；BS224S电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；ECLIPSE Ci 生物显微镜：日本Nikon 公司；XFS-280 手提式压力蒸汽灭菌锅：浙江新丰医疗器械有限公司；DG250 厌氧工作站：英国Don Whitley 公司；vetiri 梯度基因扩增仪：美国AB 公司；UVPCDS8000 凝胶成像分析系统：美国ProteinSimple 公司；LRH-150 生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；PGJ-10-AS 纯水仪：武汉品冠仪器设备有限公司；DYY-12 电泳仪：北京六一仪器厂；SA402B 味觉分析系统：日本Insent 公司；PEN3 便携式电子鼻：德国Airsense 公司；LC-20ADXR 高效液相色谱仪：日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 乳酸菌的分离纯化

每份鲊广椒样品取5 g 于150 mL 石蕊牛乳培养基中 37 ℃增殖培养 24 h 后，选 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66 个梯度进行倍比稀释，继而用移液器吸取200 μL各梯度稀释液分别涂布于含有碳酸钙的MRS 固体培养基上，并于厌氧工作站中37 ℃培养48 h，厌氧工作站通入体积比为85 ∶10 ∶5 的氮气、氢气和二氧化碳混合气体[12]。挑选平板上有溶解圈且形态、大小和颜色等均不相同的菌落进行2 次划线，并将得到的单一菌株进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验，选择革兰氏阳性和过氧氢酶阴性的菌株定义为疑似乳酸菌菌株，并用甘油管冷冻保藏法保藏后置于-80 ℃备用。

1.3.2 乳酸菌基因组DNA 提取、16S rRNA 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增和菌株鉴定

使用CTAB 法进行DNA 提取[13]，提取后的DNA样品置-20 ℃暂存备用。以此DNA 为模板，利用PCR 扩增其 16S rRNA 基因片断。PCR 扩增体系（50 μL）的配制：27F 和 1495R 各 1 μL、模板 1 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、Taq 酶 0.4 μL，最后加无菌超纯水37.6 μL 至 50 μL。PCR 扩增程序：94 ℃预变性 4 min，94 ℃变性 45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min30 s 循环 30 次，72 ℃延伸 10 min，4 ℃保温[12]。

取上述PCR 产物2.5 μL 进行琼脂糖凝胶电泳，胶的浓度为1%，电泳后染色观察，用凝胶成像仪照相。将扩增成功的PCR 产物用PCR 清洁试剂盒清洁，清洁后PCR 产物进行连接、转化、鉴定后送武汉天一辉远有限公司测序。序列测序结束后用DNAMAN 对序列结果进行拼接及引物序列校准，然后用于同源性比对和构建系统发育树。所得序列在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库中进行 BLAST（Basic Local Alignment SearchTool）同源性比对，以同源性大于等于99%为分界阈值鉴定待测菌株[14]，将菌株序列提交至GeneBank，获得登录号（MH656804-MH656824）。利用 MEGA7 与模式菌株进行系统进化亲缘关系研究并构建系统发育树。

此外，人们还会受到气候、就业和税率等因素的影响，那些在城市中没有比较稳定家庭的人往往对这些因素的反应会更为剧烈。选择住在农村和城郊地区居住的人们发现农村和城郊地区空气更清新、环境更安静、生活空间更大，有益于自身的身心健康。而且随着信息化的发展，较小的城镇也有方便的购物渠道以及便捷的信息获取方式。

1.3.3 植物乳杆菌纯种发酵鲊广椒样品的制备

取750 g 玉米碜、225 g 切碎的二荆条红辣椒（保留其汁液和水分）、3.15 g 花椒粉、3.15 g 胡椒粉、75 g食盐混合均匀备用。1.3.2 中分离鉴定的13 株植物乳杆菌使用MRS 液体培养基活化3 代，离心收集菌体，用50 mL 生理盐水悬浮后，按照5×106/g 原料的比例接入混合均匀的鲊广椒原料中，同时以不添加乳酸菌的样品作为对照。将2 L 玻璃泡菜坛坛口擦拭干净，使用喷壶于坛口喷洒3 mL 白酒，盖盖后自来水封口，30 ℃发酵21 d，样品备用。

1.3.4 植物乳杆菌纯种发酵鲊广椒风味、滋味和有机酸构成的评价

将10 g 鲊广椒置于样品瓶中，60 ℃保温20 min 后室温25 ℃平衡10 min。参照杨成聪等[15]的方法，使用PEN3 便携式电子鼻对其风味品质进行评价。

将50 g 鲊广椒加入150 mL 去离子水浸泡30 min后，12 000 r/min 离心10 min 取上清，上清液置于100 mL量筒中4 ℃过夜，取中间无油脂和残渣的澄清液体备用。参照王玉荣等[16]的方法，使用SA402B 味觉分析系统对其酸味、苦味、涩味、咸味、鲜味、后味A、后味B（苦味的回味）和丰度（鲜味的回味）的相对强度进行测定。

将 20.00 g 鲊广椒至 100 mL 容量瓶中，用0.01 mol/L 的磷酸二氢钾溶液定容后浸泡30 min，浸泡液 12 000 r/min 离心 10 min 取上清液过 0.45 μm 滤膜，滤液备用。参照杨成聪等[17]的方法，使用高效液相色谱法对其乳酸、乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸和柠檬酸含量进行检测。

1.3.5 数据分析

基于电子鼻和电子舌数据矩阵，使用主成分分析（principal component analysis，PCA）对植物乳杆菌纯种发酵鲊广椒的品质进行评价。使用SAS9.0 软件PCA，使用Origin 2017 软件绘图，使用Mega7.0 软件进行系统发育树绘制。

2 结果与分析

2.1 保康地区鲊广椒中乳酸菌的分离鉴定

本研究共从湖北保康地区采集以玉米和二荆条辣椒为原料制作的鲊广椒样品7 份，采用纯培养技术共分离出20 株疑似乳酸菌，在对其基因组DNA 进行提取的基础上，以16S rRNA 基因全长序列为靶点进行了PCR 扩增，使用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对产物进行了检测，结果如图1所示。

图1 16S rRNA PCR 扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoresis map of PCR amplification products of 16S rDNA

由图1可知，在凝胶成像系统下观察，20 条泳道中PCR 扩增产物条带单一且明显，长度约在1 500 bp。由此可见，PCR 无非特异性扩增，且扩增产物浓度较高，符合后续清洁、连接、转化和鉴定的需要。

将测序反馈回的序列信息进行比对后，与同源性比对结果≥99%的模式菌株进行系统发育树构建，结果如图2所示。

图2 系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree

由图2可知，分离出的20 株疑似乳酸菌被鉴定为4 个种，其中菌株HBUAS52326 和HBUAS52338 与模式株Lactobacillus brevis JCM1059 位于1 个分支上，因而鉴定为短乳杆菌（L.brevis）；菌株 HBUAS52335 和HBUAS52334 与模式株 L.alimentarius DSM20249 位于1 个分支上，因而鉴定为食品乳杆菌（L.alimentarius）；菌株HBUAS52341 与模式株L.crustorum R-27957 位于1 个分支上，因而鉴定为面包乳杆菌（L.crustorum）；其他15 株乳酸菌均与模式株L.plantarum JCM1149 位于1 个分支上，因而鉴定为植物乳杆菌（L.plantarum）。由此可见，植物乳杆菌为保康地区鲊广椒中的优势乳酸菌，占分离株总数的75.0%。值得一提的是，所有菌株与模式株的同源性均为100%，因而本研究的鉴定结果具有较高的可靠性。

2.2 植物乳杆菌纯种发酵制备鲊广椒风味品质的评价

在对保康地区鲊广椒中乳酸菌进行分离鉴定的基础上，本研究拟进一步评价植物乳杆菌纯种发酵对鲊广椒品质的影响。由于L.plantarum HBUAS52330 和L.plantarum HBUAS52331 在MRS 液体培养基中生长缓慢，因而选取了其他13 株植物乳杆菌进行了鲊广椒的制备。电子鼻各传感器对不同处理鲊广椒响应值的差异性分析如表1所示。

表1 电子鼻各传感器对不同处理鲊广椒响应值的差异性分析Table 1 Difference analysis of response value of Zhaguangjiao samples with different treatment by electronic nose

续表1 电子鼻各传感器对不同处理鲊广椒响应值的差异性分析Continue table 1 Difference analysis of response value of Zhaguangjiao samples with different treatment by electronic nose

由表1数据可知，植物乳杆菌纯种发酵的多数鲊广椒挥发性风味物质中芳香类物质和烷烃类物质明显增多，而氢氧化物、甲烷、乙醇和有机硫化物含量明显下降。因芳香类物质为鲊广椒特征性风味指标的重要组成部分，而乙醇和有机硫化物为缺陷型指标的组成部分，因而多数植物乳杆菌进行纯种发酵可明显提升鲊广椒的风味品质。

2.3 植物乳杆菌纯种发酵制备鲊广椒滋味品质的评价

在使用电子鼻对植物乳杆菌纯种发酵鲊广椒风味品质进行评价的同时，进一步使用电子舌对其滋味品质进行评价。在进行数据处理时，将自然发酵的鲊广椒各滋味品质均设置为0，各植物乳杆菌纯种发酵鲊广椒样品减去自然发酵鲊广椒各滋味指标的原始强度值即为其相对强度值。植物乳杆菌纯种发酵鲊广椒各滋味指标相对强度的箱形图如图3所示。

图3 植物乳杆菌纯种发酵鲊广椒各滋味指标相对强度的箱形图Fig.3 Box plot of response value of Zhaguangjiao samples fermented by L.plantarum with electronic tongue

由图3可知，鲊广椒样品在涩味、酸味和鲜味3 个指标上的差异性较大，其极差值分别为3.36、3.26 和2.88；其次为咸味、苦味和丰度（鲜味的回味），极差值分别为2.10、1.81 和1.00；而在后味B（苦味的回味）和后味A（涩味的回味）2 个指标上的差异较小，极差值仅为0.94 和0.75。由图3亦可知，植物乳杆菌纯种发酵制备的鲊广椒酸味、咸味、鲜味和丰度（鲜味的回味）相对强度明显高于自然发酵，而多数样品的苦味和涩味呈现出相反的趋势。

由于酸味和鲜味为鲊广椒的特征性指标，而苦味和涩味为缺陷型指标，因而采用植物乳杆菌纯种发酵制备鲊广椒可明显提升产品的滋味品质。本研究进一步采用高效液相色谱法对鲊广椒中有机酸的种类和含量进行了分析，结果如图4所示。

图4 植物乳杆菌纯种发酵鲊广椒各有机酸含量的箱形图Fig.4 The box plot of content of organic acids in Zhaguangjiao samples fermented by L.plantarum

由图4可知，乳酸和乙酸为鲊广椒中的主要有机酸，本研究制备的14 个鲊广椒样品中其平均含量分别为2.58 mg/g 和1.44 mg/g；其次为草酸、酒石酸和琥珀酸，平均相对含量分别为1.24、1.05 mg/g 和0.77 mg/g；虽然含有苹果酸和柠檬酸，但平均相对含量仅为0.39 mg/g 和0.37 mg/g。由图4亦可知，植物乳杆菌纯种发酵制备的鲊广椒中乳酸和酒石酸含量明显偏高，这可能是导致鲊广椒样品酸味升高的主要原因。

2.4 基于PCA植物乳杆菌纯种发酵制备鲊广椒品质的评价

进一步采用PCA 以电子鼻和电子舌的18 个指标为参数，采用因子载荷图对各指标进行了分类，同时采用因子得分图对不同处理鲊广椒样品进行了空间排布。因子载荷图如图5所示。

图5 基于PCA 的PC1 和PC2 因子载荷图Fig.5 Factor loading diagram of PC1 and PC2 based on PCA

由图5可知，第一主成分（principal component 1，PC1）与PC2 的贡献率分别为48.19%和19.96%，在进行PCA 时若主成分贡献率越大则表示该主成分反映原有多指标的信息越全面[18]。由此可见，仅采用PC1 和PC2 信息即可反映本研究近70%的数据信息，因而本研究的分析结果相对可靠。由图5亦可知，PC1 主要由W1C、W3C、W5C、W1W、W5S、W2W、W1S 和 W2S 构成，且 W1C、W3C、W5C 这 3 个对芳香类物质敏感的传感器均位于X 轴负方向；PC2 主要由酸味、苦味、涩味和后味B（苦味的回味）构成，且鲊广椒的特征性风味物质酸味主要位于Y 轴负方向。由此可见，PC1 主要由风味指标构成，PC2 主要由滋味指标构成，且在因子得分图中空间排布越偏向左下方的鲊广椒样品其品质越好。因子得分图如图6所示。

图6 基于PCA 的PC1 和PC2 因子得分图Fig.6 Factor scores diagram of PC1 and PC2 based on PCA

由图6可知，植物乳杆菌纯种发酵制备的多数鲊广椒样品空间排布较之对照组偏向左下方，因而多数植物乳杆菌进行纯种发酵可明显提升鲊广椒的品质。较之其他菌株，L.plantarum HBUAS52332 制备的鲊广椒虽然风味品质一般，但其酸味较为浓郁，L.plantarum HBUAS52327 制备的鲊广椒风味和滋味品质均较佳。由此可见，L.plantarum HBUAS52327 和L.plantarum HBUAS52332 可进一步用于后续具有优良鲊广椒发酵特性菌株的筛选。

3 结论

植物乳杆菌为保康地区鲊广椒中的优势乳酸菌，多数植物乳杆菌菌株进行纯种发酵可明显提升鲊广椒的风味和滋味品质。乳酸和乙酸为鲊广椒中的主要有机酸，植物乳杆菌纯种发酵制备的鲊广椒中乳酸和酒石酸含量明显偏高。L.plantarum HBUAS52327 和L.plantarum HBUAS52332 纯种发酵制备的鲊广椒样品具有较好的品质，可进一步用于后续具有优良鲊广椒发酵特性乳酸菌菌株的筛选。