QuEChERS-VADLLME-内标法-GCMS/MS快速测定铁皮石斛中的农药残留

周敏，朱萌萌，王珍，王川丕，周婷婷，刘芯成

（绿城农科检测技术有限公司，浙江杭州310052）

铁皮石斛为兰科石斛属植物，其含有多糖、芪类、生物碱、氨基酸和微量元素等多种成分，具有增强免疫、抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、降血糖和养阴生津等多种保健功能，是我国传统名贵药材，分布于福建、浙江、广西、云南等地，是国家列为重点保护的药用植物之一。近年来，铁皮石斛人工繁育的关键技术得到了较大突破，并得到迅速的推广和应用，形成了完整的产业链。然而铁皮石斛产业发展的同时也使消费者对其人工栽培过程中可能存在的农药残留问题感到担忧，农药的过度使用会严重影响铁皮石斛及其产品的质量[1-2]。2015 版《中国药典》[3]虽收载了铁皮石斛的质量标准，但对农药残留问题却未加以严格控制。目前对铁皮石斛农残检测的相关报道较少[4-5]，因此，对铁皮石斛中的多种农药残留量进行检测具有十分重要的意义。

目前，农药多残留的检测方法主要有气相色谱法[6-7]、液相色谱法[8-11]、气相色谱[12]或液相色谱[13-15]与质谱联用法等，而目前所用的各类前处理提取净化方法文献报道的加速溶剂萃取（accelerated solvent extraction，ASE）、固相萃取（solid phase extraction，SPE）法、凝胶色谱法（gel permeation chromatography ，GPC）等，普遍存在繁琐耗时、操作误差偏大，需使用大量对人体和环境有毒或有害的有机溶剂、难以实现自动化等缺点。因此发展省时高效、有机溶剂用量少的样品前处理新技术己成为分析化学研究的热点之一。

QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged and safe）是目前广泛应用于果蔬中农药残留检测的前处理方法之一[16]。分散液液微萃取（dispersive liquidliquid microextraction ，DLLME）是 Rezaee 等[17]于 2006年首次报道的一种前处理方法，该方法集采样、萃取、浓缩于一体，操作简单、快速、成本低、有机溶剂用量少、对环境友好且富集效率高，在分析领域具有良好的应用前景[18-21]。本研究将涡旋辅助的分散液相微萃取技术与QuEChERS 结合，气相色谱-串联质谱仪内标法检测，建立了铁皮石斛中农药残留的快速分析方法。该方法简单、高效、富集效率高，方法的准确度、精密度和灵敏度均符合农药残留分析的要求。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

铁皮石斛：市售。

乙腈（色谱纯）：美国TIDE 公司；甲醇、丙酮、正己烷（色谱纯）：美国J.T.Baker 公司；氯苯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳（分析纯）：华东医药公司；氯化钠（分析纯）：广东光华科技股份有限公司；C18（500 g）、N-丙基乙二胺（N-propyl ethylenediamine，PSA）（500 g）：天津博纳艾杰尔科技有限公司。

内标品：外环氧七氯（纯度≥99.0%）：德国Dr.Ehrenstorfer 公司。

标准品：特丁硫磷、五氯硝基苯、乙烯菌核利、甲基毒死蜱、甲基对硫磷、杀螟硫磷、毒死蜱、三唑酮、对硫磷、二甲戊灵、腐霉利、甲氰菊酯（纯度≥99.5%）：德国Dr.Ehrenstorfer 公司。

TQ8040 气相色谱-串联质谱仪：日本岛津公司；ST16R 离心机：赛默飞世尔公司；BSA2202S 电子天平：德国赛多利斯公司；EUFO-945616 漩涡混合器：TALBOYS；KQ5200E 超声波清洗器：昆山舒美超声仪器有限公司；R215 旋转蒸发仪：瑞士Buchi 公司；MTN-5800 氮吹仪：天津奥特赛恩斯仪器有限公司。

1.2 仪器条件

1.2.1 气相条件

色谱柱：Agilent 安捷伦VF-5MS 色谱柱（30 m×0.25 mm × 0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；柱流量：1.00 mL/min；采用程序升温：起始柱温80 ℃，保持0 min，以 40 ℃/min 升温至 250 ℃，保持 0 min，再以20 ℃/min 升温至 290 ℃保持 3.75 min，总用时 10.00 min；进样量：1 μL；进样方式：不分流进样；载气：高纯氦气；碰撞气：高纯氩气，纯度≥99.999%。

1.2.2 质谱条件

电离方式：EI；色谱-质谱接口温度：280 ℃；电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；检测器电压：0.99 kV（+0.4 kV）；测定方式：MRM 多重反应监测模式；定量方式：内标法。各农残的定性、定量离子和MRM 参数见表1。

表1 12 种化合物的优化质谱MRM 参数Table 1 Optimized mass spectrometry MRM parameters for 12 compounds

1.3 样品前处理

将铁皮石斛样品捣碎后在匀浆机中匀浆，称取2.00 g 置于15 mL 带刻度尖底离心管，加入5.0 mL 乙腈涡旋30 s，超声提取15 min，涡旋30 s 后，于8 000 r/min离心3min。取上清液2.0mL 加入盛有50mgPSA、50mg C18粉的塑料离心管中，涡旋1 min，然后以8 000 r/min离心3 min，取上清液过0.22 μm 滤膜待DLLME 用。

向装有4 mL 超纯水的5 mL 尖底具塞玻璃离心管中加入1 mL 上述净化提取液，然后再加入100 μL CCl4，涡旋 30 s，以 8 000 r/min 离心 3 min。用 100 μL微量注射器取出沉积相装入带有内插管的进样瓶中，氮气吹干，加入10 μL 20 mg/kg 外环氧七氯，再加入正己烷 90 μL 定容，待 GC-MS/MS 测定。

1.4 工作曲线的绘制

准确称取2.00 g 匀浆的铁皮石斛样品（不含被测农药组分），称取8 等份（其中1 份空白基质样品），各加入一定体积的农残混合标准溶液，使其终浓度为0.000 4、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/kg，按 1.3方法进行前处理后，上机分析做基质标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 QuEChERS 提取剂的选择

QuEChERS 前处理中常用甲醇、乙腈与丙酮作为农药残留的提取剂，在样品中添加一定量标准混合溶液，分别用相同体积的乙腈、丙酮、甲醇提取，结果表明，与甲醇、丙酮相比，乙腈的提取效果优于其他，并且乙腈提取铁皮石斛中色素、蜡质、脂肪等非极性成分的能力相对较弱，更容易通过后续加入吸附剂除去基质的干扰物质，本试验选取乙腈作为QuEChERS 过程的提取剂。提取剂种类对回收率的影响见图1。

图1 提取剂对回收率的影响Fig.1 Effect of extractant on recovery

2.1.1.1 提取时间的选择

在QuEChERS 阶段，提取时间是影响萃取效率的一个重要因素。提取时间过短，提取剂能对目标物提取不充分；提取时间过长，虽对目标物提取充分，但同时也会萃取出较多的基质杂质且耗时。本试验选取5 min～25 min 时间来对提取时间进行优化，结果表明，当提取时间由5 min 增加至15 min，萃取效率呈逐渐增加的趋势，由15 min 增加至25 min，回收率基本保持不变，故15 min 作为本试验QuEChERS 过程的最佳提取时间。

2.1.1.2 提取剂体积的选择

提取剂体积也是影响QuEChERS 过程萃取效率的因素之一。以铁皮石斛为研究对象，准确称量2.00 g样品，添加水平为100 μg/kg 时，分别考察了乙腈体积为 3、5、10、15、20 mL 时对农药残留的提取效果。结果表明，采用5 mL 乙腈能达到充分提取目标分析物的目的，同时考虑到样品经过QuEChERS 过程后还要进VADLLME 程序，为取得较大的富集因子，本试验选取5 mL 作为最佳提取剂体积。

2.1.1.3 吸附剂种类和数量的选择

由于铁皮石斛样品基质比较复杂，如蛋白质、脂肪，糖类，色素等成分等，本试验选取了QuEChERS 常用净化剂PSA、C18两种吸附剂的4 种组合（25 mg PSA+25 mg C18、50 mg PSA+50 mg C18、100 mg PSA+100 mg C18、150 mg PSA+150 mg C18）对铁皮石斛的乙腈提取液进行净化，PSA 能有效去除样品基质中的有机酸、色素和糖类，C18能有效去除样品基质中的有机酸、脂肪酸、碳水化合物和色素等。结果如图2。当加入50 mg PSA与50 mg C18时效果最好，回收率最高，本试验选取50 mg PSA 与50 mg C18作为净化吸附剂。

图2 吸附剂种类和数量对回收率的影响Fig.2 Effect of the type and amount of adsorbent on recovery

2.1.2 涡旋辅助的液液微萃取（vortex-assisted liquidliquid microextraction，VADLLME）过程优化

2.1.2.1 萃取溶剂的选择及萃取体积的优化

本试验考察了二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳及氯苯4 种氯代有机溶剂作为萃取剂，以适量乙腈（1 mL）为分散剂，以各农药含量计算回收率，按1.3 方法进行萃取测定，通过比较回收率选择合适的萃取剂，试验结果见图3。

图3 萃取剂种类对回收率的影响Fig.3 Effect of extractant species on recovery

由图3可知，四氯化碳与氯苯的萃取效果较好，且两者相当，二氯甲烷的回收率为43.2%～55.2%，三氯甲烷的回收率为38.4%～54.0%，氯苯为63.2%～93.4%，四氯化碳回收率为77.8%～98.3%，虽然四氯化碳与氯苯萃取效果相差不大，但氯苯作为萃取剂时，会有更多的杂质伴随目标物共同被萃取，因此四氯化碳被选为最佳萃取剂继续下面的试验。

为考虑萃取剂体积对回收率的影响，本试验选取了体积分别为 60、80、100、120、140 μL 的四氯化碳。结果如图4所示。

图4 萃取剂体积对回收率的影响Fig.4 Effect of extractant volume on recovery

由图4可知，当萃取剂体积由60 μL 增加至100 μL时，所有农药的回收率均变大，然而增加至140 μL 时，回收率没有显著的变化，基本保持不变。故在后续试验中，100 μL 的四氯化碳被选为最佳萃取剂体积。

萃取剂体积减少可以适当的提高农药的富集因子，即提高沉积相中农药的浓度；但是萃取剂体积过小时不仅会减少沉积相的体积，导致自动进样困难，而且还会造成水相中农药提取不完全而影响提取效率。萃取剂体积与沉积相体积的关系见图5。

2.1.2.2 分散溶剂选择及分散体积的优化

本试验中QuEChERS 阶段所获取的乙腈提取液同时作为VADLLME 过程的分散剂，分散剂的体积会对DLLME 萃取效率产生影响，分散剂体积太小时，不能将萃取剂完全分散到样本溶液中形成乳浊液，而导致萃取效率降低，但分散剂体积过大时，目标分析物在萃取剂中的分配系数降低，也会导致萃取效率下降。试验以100 μL 四氯化碳为萃取剂，考察了分散剂乙腈的体积（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL）对萃取效果的影响，结果见图6。

图5 萃取剂体积与沉积相体积的关系Fig.5 Relationship between extractant volume and sedimentary phase volume

图6 分散剂体积对回收率的影响Fig.6 Effect of dispersant volume on recovery

由图6可知，在 0.5 mL～1.0 mL 范围内，待测物的萃取富集效果随着乙腈体积的增加而增加，在乙腈体积为1.0 mL 时达到最大值，之后萃取效果随着乙腈用量的增加而降低。原因是随着乙腈用量的增加，待测物在水中的溶解度也随之增大，萃取效率降低。因此试验中乙腈的最佳用量为1.0 mL，对于接下来的试验，1.0 mL 的乙腈提取液被确定为最优分散剂体积。

2.1.2.3 萃取时间的选择

萃取时间对回收率的影响见图7。

图7 萃取时间对回收率的影响Fig.7 Effect of extraction time on recovery

本方法中萃取时间是指从样品溶液中注入萃取剂和分散剂到混合液开始离心的时间间隔。分别考察了萃取时间为 10、20、30、40、50、60 s 时方法的萃取效率。由图7可知，萃取时间30 s 后萃取效果基本趋于稳定，回收率最高，之后时间增加对萃取效率没有显著地影响，因为在混合液形成乳浊液之后，四氯化碳被均匀的分散在了水相中与待测物接触面积大，待测物可以快速的由水相转移到有机相并且很快的达到两相平衡。本试验选取萃取时间为30 s。

2.1.2.4 离心机转速和时间的选择

离心机转速对回收率的影响见图8。

图8 离心机转速对回收率的影响Fig.8 Effect of centrifuge speed on recovery

本试验采用塑料离心管离心，通过选用不同转速，观察离心分层效果，结果表明，在8 000 r/min 转速下离心后，会取得比较好的分层效果，因此本试验最终确定离心机转速为8 000 r/min。

离心时间对回收率的影响见图9。

对于离心时间，本试验选择了8 000 r/min 离心3、5、10、15 min，结果表明，离心时间并不影响萃取效率。故离心时间选择3 min。

2.1.2.5 盐对萃取效果的影响

通过在水相中加入NaCl（0～10%）的方法考察了盐浓度对萃取效率的影响。随着NaCl 浓度的增大，12种农药的回收率变化很小，但是富集倍数显著下降。这是由于离子强度的增加使有机萃取剂在水相中的溶解度减小，最后得到的有机沉积物的体积增加所造成的。所以本试验不加盐。

2.1.2.6 样品溶液pH 值的影响

通过在水相中加入磷酸二氢钠或氢氧化钠稀溶液，调解待测溶液 pH 值分别为 3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，pH 值对回收率的影响见图10。

由图10可知，pH 值为7.0 时回收率最高，可能是过酸或过碱破坏了目标物的分子结构，回收率不稳定。所以本试验确定样品溶液的pH 值为7.0 时为最佳条件。

图9 离心时间对回收率的影响Fig.9 Effect of centrifugal time on recovery

图10 pH 值对回收率的影响Fig.10 pH to the influence of recovery

2.2 质谱条件的优化

选择MRM 模式下的离子对进行各农药的分析。为了获得最佳的质谱条件，保证对分析物定量和定性的准确性，对待测物的母离子、产物离子、碰撞能量等一系列质谱参数进行了优化。一定浓度下的12 种化合物混标MRM 色谱图见图11。

2.3 方法的富集倍数、线性范围、检出限及定量下限

在最优的试验条件下，对系列浓度的标准溶液进行萃取测定，12 种农药残留在0.002 mg/kg～0.5 mg/kg范围内均具有良好的线性关系，检出限为0.353 μg/kg～1.14 μg/kg（S/N≥3），定量下限为 1.06 μg/kg～3.43 μg/kg（S/N≥10），富集倍数可以达到 47 倍～106 倍，可满足实际样品的测定。12 种农药残留的检出限（limit of detection，LOD）、定量下限（lower limit of quantitation，LOQ）、线性方程、相关系数及线性范围见表2。

结果表明，本方法中12 种农药残留的检出限远低于现行的《中华人民共和国药典》2015年版第四部中2341 农药残留量测定方法检出限。

2.4 方法的回收率

在最优的试验条件下，选用阴性铁皮石斛样品，进行不同添加浓度的萃取、测定。对12 种农药残留添加含量分别为0.001、0.01、0.05 mg/kg 的铁皮石斛样品平行萃取测定6 次，测得铁皮石斛中，12 种农药的加标回收率为77.5 %～97.7 %，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.6%～8.4%，试验结果见表3。铁皮石斛空白基质见图12。

图11 12 种农药混标的MRM 色谱图Fig.11 MRM chromatogram of 12 pesticides mixed

表2 12 种农药的检出限、定量下限、线形回归方程、相关系数及线性范围Table 2 LODs，LOQs，regression equation，correlation coefficient and linear equation of 12 kinds of pesticides

续表2 12 种农药的检出限、定量下限、线形回归方程、相关系数及线性范围Continue table 2 LODs，LOQs，regression equation，correlation coefficient and linear equation of 12 kinds of pesticides

2.5 与中国药典方法比较

本方法与现行的《中华人民共和国药典》2015年版第四部中2341 农药残留量测定方法进行比较，通过对检出限和空白铁皮石斛样品用2 种不同方法进行添加回收试验比较可以看出：本试验在方法检出限和回收率上均取得相对较为理想的结果，且前处理方法简单，试剂耗材用量少，对环境友好，完全能够满足日常的铁皮石斛样品的检测工作。具体比较见表4。

表3 不含本底样品中各种农药的添加回收率和精密度（n=6）Table 3 The rate pesticide of recovery and relative standard deviation of in blank sample（n=6）

图12 铁皮石斛空白基质图Fig.12 Blank matrix of Dendrobium candidum

表4 与中国药典方法12 种农药检出限和回收率的比较（添加量0.05 mg/kg）Table 4 Compared of two method about LODs and Recovery of 12 kinds of pesticides（Added 0.05 mg/kg）

2.6 不同铁皮石斛样品基质的检测

中药材成分复杂，对于农药残留的检测也有一定的影响。本试验对铁皮石斛中农药残留的基质效应进行了研究，使用PSA 和C18小粉净化后结合GC-MS/MS 采集数据及未净化后样品结合GC-MS/MS 采集数据，分别使用丙酮溶液和空白基质溶液配置农药混合标准溶液并建立标准曲线，通过比较两组标准曲线的斜率考察基质效应的影响，结果见表5。

表5 各农药组分标准曲线斜率的比值Table 5 Ratios of calibration curve slope of pesticides

由表5可知，两组标准曲线斜率的比值分别在0.975～1.286 和 0.944～1.091 之间，说明使用 PSA 及 C18小粉净化后结合GC-MS/MS 方法有效去除了铁皮石斛中的大部分色素和油脂等杂质，从而减少了农药组分的基质效应。为了避免药材本身带来的基质效应，采取基质混合标准品溶液的方法消除和减弱基质效应，同时利用选择离子定量检测也可以大大提高分析方法的选择性，排除一些杂质的干扰。在对不同铁皮石斛样品的检测中发现：虽然铁皮石斛样品基质较为复杂，有几个较大杂质干扰峰，但通过净化、离心、基质标样消除干扰和GC-MS/MS 联用检测，能基本满足要求。

2.7 样品测定

用本方法检测了各地具有代表性的铁皮石斛样品共100 批次，发现毒死蜱和五氯硝基苯这2 个农药有检出，但均未超标，符合使用要求。

3 结论

本研究将涡旋辅助的分散液相微萃取技术与QuEChERS 结合，气相色谱-串联质谱仪内标法检测，建立了铁皮石斛中农药残留的快速分析新方法。方法优化了前处理，各参数的色谱、质谱条件，且灵敏度高，检出限为 0.353 μg/kg～1.14 μg/kg，方法的准确度（回收率为77.5%～97.7%），精密度（相对标准偏差为0.6%～8.4%），均能很好地满足不同铁皮石斛中农药残留的分析要求。目前分散液相微萃取技术还主要用于简单基质成分，而本试验的结果表明，该技术通过与串联质谱联用，用内标法定量，应用于铁皮石斛样品和多种农药残留也可取得满意的结果，这对于拓宽分散液相微萃取技术的应用范围具有指导意义。