芪苈强心胶囊中酚酸类成分在大鼠体内药动学研究*

张 瑜，张富赓，朱明丹，张少强，杜武勋，肖学凤

（1.天津中医药大学，天津 301617；2.天津市环湖医院，天津 300350；3.天津中医药大学第二附属医院，天津 300150）

近年来，慢性心力衰竭的发病率呈上升趋势，成为心血管疾病患者的主要死亡原因之一[1]。芪苈强心胶囊首次收载于2015版《中国药典》中，具有益气温阳，活血通络，利水消肿的功效。多中心临床试验研究显示芪苈强心胶囊联合西药能够提高慢性心力衰竭患者的运动耐力和生活质量，降低心血管事件和再住院率[2-3]。丹参为方中臣药，配伍人参、葶苈子，具有通经活血利水的功效。其中丹参的酚酸类化合物是心脏保护作用的主要活性物质，具有保护心肌缺血再灌注损伤、保护血管内皮细胞、抗血栓及抗动脉粥样硬化等多种药理活性[4]，作用机制涉及改善心肌能量代谢、抑制炎症反应和氧化应激、提高心肌细胞活力、抑制凋亡等[5-8]。因此，本实验建立高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）的方法测定芪苈强心胶囊中臣药丹参的6种酚酸类活性成分（丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素、紫草酸、迷迭香酸及原儿茶酸）的血药浓度，并研究上述活性成分在大鼠体内的药动学特征，为进一步明确芪苈强心胶囊的药效物质基础提供实验依据。

1 材料和仪器

HPLC-MS/MS质谱仪：采用API 4000 trap液质联用系统，SER.N：AR26221101（美国应用生物系统公司，装备岛津LC-20 AD泵、SIL-20 AC恒温自动进样器、CBM-20 A控制器、CTO-20 A柱温箱、AnalystSoftware色谱工作站（1.5.2版本）），XS205型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司），Sorvall RC6+型离心机（美国Thermoscientific公司），MIKRO 220R型低温高速离心机（德国Hettich公司），Targin VX-02多管蜗旋振荡器（北京踏锦科技有限公司）。

芪苈强心胶囊（丹酚酸A0.772mg/g，丹酚酸B 3.987mg/g，丹参素 1.770mg/g，紫草酸 0.337mg/g，迷迭香酸0.354mg/g，原儿茶酸0.050mg/g）[9]购自石家庄以岭药业（批号140805）；标准品丹酚酸B（批号111562-201515，质量分数96.2%），丹参素（批号110855-201614，质量分数98.1%），迷迭香酸（批号111871-201505，质量分数98.5%），原儿茶酸（批号110809-201205，质量分数99.9%）均购自中国食品药品检定研究院；丹酚酸A（批号H1315006，质量分数≥98%），紫草酸（批号H1624050，质量分数≥98%）均购自上海阿拉丁试剂有限公司；水为超纯水，乙腈、甲酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

SPF级健康雄性SD大鼠（200～240 g）由解放军军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号SCXK（军）2012-0004，在天津中医药大学的动物房内饲养，适应性喂养1周后进行实验。本课题经过天津中医药大学伦理委员会批准（批准号：TCMCAEC2015023）。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件 Agilent ZOBRAX XDB-C18（4.6mm×50mm，3.5μm），柱温 40℃，流动相 0.1%甲酸水溶液（A）-含0.1%甲酸的乙腈溶液（B）梯度洗脱（0.01～0.6min，7%B；0.6～0.8min，7%～15%B；0.8～7.8 min，15%～65%B；7.8～8.8 min，65%～100%B；8.8～9.8min，100%B；9.8～9.81min，100%～7%B；9.81～12min，7%B），流速0.45mL/min，进样量10μL。

电喷雾离子源（ESI），负离子模式检测，多反映监测（MRM）扫描方式，喷雾电压-4 200 V，脱溶液温度600℃，气帘气20 L/min，雾化气65 L/min，加热辅助气55 L/min。6种酚酸类成分质谱参数见表1。

2.2 溶液的配制

表1 6种酚酸类成分和内标（IS）的质谱参数Tab.1 M ainmass parametersof six phenolic acidsand internalstandard

2.2.1 标准品溶液 精密称取丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素、紫草酸、迷迭香酸及原儿茶酸标准品适量，分别加二甲基亚砜（DMSO）溶解并稀释成2mg/mL的储备液。分别精密吸取上述储备液适量，混合并用甲醇∶水（1∶1）溶液进行逐级稀释，得到混合标准品系列溶液质量浓度如下：丹酚酸A、原儿茶酸（5、10、25、100、250、1 000、2 500、5 000、1×104ng/mL）；丹酚酸 B、紫草酸、迷迭香酸（10、20、50、200、500、2 000、5 000、1×104、2×104ng/mL）；丹参素（50、100、250、500、1 000、2 500、1×104、2.5×104、1×105ng/mL），上述储备液和标准系列溶液均置于4℃储存。

2.2.2 内标溶液 精密称取氯霉素标准品适量，加甲醇∶乙腈（1∶1）溶解摇匀，配制成浓度 100 ng/mL 的内标溶液（IS），置于4℃储存备用。

2.3 血浆样品处理 取大鼠血浆样品50μL，依次加入5μL标准溶液（50%甲醇水）、10μL维生素C（1.4 mg/mL-100%H2O）和 150μL IS溶液，涡旋30 s，离心 10min（4 ℃ 15 000 r/min），取上清液 10μL进样分析。

2.4 方法学验证

2.4.1 专属性考察 分别取空白血浆（等体积甲醇代替内标溶液）、空白血浆+标准品（丹酚酸A、原儿茶酸血浆样品溶液的质量浓度为0.5 ng/mL，丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸血浆样品溶液的质量浓度为1ng/mL，丹参素血浆样品溶液的质量浓度为5 ng/mL）及灌胃给予芪苈强心胶囊混悬液后20min的大鼠血浆样品，按2.3项处理血浆样品，并按2.1项下条件进行HPLC-MS/MS分析，得到空白血浆、空白血浆+标准品和给药后血浆样品的色谱图，结果见图1。结果表明：丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素、紫草酸、迷迭香酸、原儿茶酸及IS的保留时间分别为7.42、7.59、4.97、7.41、7.45、6.78 及 8.23min，各酚酸类成分和IS能够完全分离，不会受到大鼠血浆样品中杂质及内源性物质的干扰，方法专属性良好。

2.4.2 线性关系考察 取大鼠空白血浆50μL，加入混合标准品系列溶液，得到质量浓度为0.5、1、2.5、10、25、100、250、500、1 000 ng/mL 的丹酚酸 A和原儿茶酸血浆样品溶液；1、2、5、20、50、200、500、1 000、2 000 ng/mL的丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸血浆样品溶液；5、10、25、50、100、250、1 000、2 500、1×104ng/mL的丹参素血浆样品溶液。根据2.3项处理血浆样品，并按2.1项下条件进行HPLC-MS/MS分析。以标准品质量浓度为横坐标（X），标准品与内标峰面积比值为纵坐标（Y）进行线性回归分析，结果见表2。

2.4.3 精密度与准确度考察 取大鼠空白血浆，加入低、中、高3个质量浓度的混合标准品溶液，得到丹酚酸 A（1、25、800 ng/mL），丹酚酸 B（2、50、1 600 ng/mL），丹参素（10、250、8 000 ng/mL），紫草酸（2、50、1 600 ng/mL），迷迭香酸（2、50、1 600 ng/mL）及原儿茶酸（1、25、800 ng/mL）低、中、高3 个质量浓度的质控样品（QC），根据2.3项处理血浆样品，并按2.1项下条件进行HPLC-MS/MS分析。于同日内连续进样6次，计算日内精密度；连续测定3 d，计算日间精密度，并测定均值与真实值的相对误差，计算准确度。精密度以相对标准偏差（RSD）表示，准确度以相对误差（RE）表示，结果见表3。在上述3个质量浓度下，各成分日内和日间精密度的RSD均＜15%，且准确度的RE在±15%之间，符合生物样品测定的要求。

图1 空白血浆（1）、空白血浆+标准品（2）和灌胃1.3g/kg芪苈强心胶囊后20m in的含药血浆（3）的HPLC-MS/MS色谱图Fig.1 HPLC-MS/MS chromatogram of blank p lasma（1），blank p lasma+reference substances（2），and plasma samples after oraladm inistration of1.3 g/kg QiliQiangxin Capsule at20m in（3）

表2 6种酚酸类成分的线性方程、相关系数（r）、线性范围和定量下线（LLOQ）Tab.2 Regression equation，correlation coefficient（r），linearity range and LLOQ of six phenolic acids

2.4.4 基质效应与回收率考察 取上述低、中、高3个质量浓度的QC样品，根据2.3项处理血浆样品，并按2.1项下条件进行HPLC-MS/MS分析，记录成分峰面积（A）；另取甲醇水溶液代替空白血浆，其余操作如上，得到成分峰面积（B）；另取大鼠空白血浆，根据2.3项处理血浆样品后加入QC样品，进样分析，记录成分峰面积（C），A和B的比值为基质效应，A和C的比值为回收率，结果见表3。各成分和IS的基质效应的范围在80.5%～104%，回收率的范围在81.0%～103%。

2.4.5 稳定性考察 取上述低、中、高3个质量浓度的QC样品，各6份，考察样品在自动进样器中放置24 h（样品处理后稳定性），室温放置24 h（短期稳定性），在-20℃条件下冻融3次（冻融稳定性）及在-80℃条件下放置30 d（长期稳定性）的稳定性，结果见表4。血浆中6种酚酸类成分稳定性的RSD均＜15%，说明样品在上述条件下放置均稳定。

2.5 药动学研究 取6只雄性SD大鼠，实验前大鼠禁食12 h，自由饮水。灌胃给予芪苈强心胶囊混悬液（0.5%CMC-Na配制成混悬液），给药剂量1.3 g/kg，于给药后 0.083、0.167、0.333、0.667、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h 经目内眦静脉丛取血 0.5mL，置于肝素钠抗凝管中，在12 000 r/min的条件下离心10min，分离血浆，置于-20℃的冰箱中保存待测，测定前根据2.3项处理血浆样品。大鼠灌胃芪苈强心胶囊后血浆中6种酚酸类成分（丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素、紫草酸、迷迭香酸及原儿茶酸）的药时曲线如图2。采用DAS 3.0软件非房室模型计算药动学参数，结果见表5。

表3 血浆样品中6种酚酸类成分的精密度、准确度、基质效应和回收率（n=6）Tab.3 Precision，accuracy，matrix effectand recovery of six phenolic acids in plasma sam ples（n=6）

3 讨论

本实验建立HPLC-MS/MS方法同时测定大鼠灌胃芪苈强心胶囊后，血浆中丹参的6种酚酸类活性成分（丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素、紫草酸、迷迭香酸、原儿茶酸）的血药浓度，经方法学考察符合生物样品测定的要求，可用于生物体内的药动学研究。实验初期对质谱条件进行优化，根据文献报道[10-11]酚酸类成分在负离子模式下响应良好，本实验对正、负离子两种扫描方式下待测物的响应强度进行了比较，结果显示在负离子模式下灵敏度更高，可以获得稳定的[M-H]-，因此选用负离子模式对待测物进行检测。在对色谱条件优化时，酚酸类成分检测的流动相多为加入酸的水-乙腈系统[12]，因此实验选择0.1%甲酸水溶液（A）-含0.1%甲酸的乙腈溶液（B）为流动相，结果显示各待测物分离效果最佳，色谱峰峰形较好。

表4 血浆样品中6种酚酸类成分的稳定性（n=6）Tab.4 Stability of six phenolic acids in plasma samples under differentstorage conditions（n=6）

表5 大鼠灌胃芪苈强心胶囊后6种酚酸类成分的药动学参数（n=6）Tab.5 PK parametersof six phenolic acidsafter oral adm inistration ofQiliQiangxin Capsule（n=6）

图2 大鼠灌胃芪苈强心胶囊后血浆中6种酚酸类成分的药时曲线（n=6）Fig.2 M ean concentration-time profilesof six phenolic acidsafter oraladm inistration of QiliQiangxin Capsule（n=6）

本实验大鼠体内丹酚酸A，丹酚酸B，丹参素，紫草酸，迷迭香酸，原儿茶酸均存在明显的双峰现象，表明芪苈强心胶囊中上述酚酸类成分在体内可能通过肝肠循环进行重吸收。据文献报道大鼠灌胃丹参提取物后，酚酸类成分吸收表现为单峰[13-14]或双峰[15-16]，而复方中药芪苈强心胶囊成分复杂，且酚酸类成分存在同系物转化，丹酚酸B可通过水解掉一分子丹参素成为紫草酸，再脱羧转化成丹酚酸A，而丹酚酸A可进一步降解成为丹酚酸C和异丹酚酸C[17]，另在生物体内大分子的丹酚酸A、丹酚酸B和迷迭香酸可转化成小分子丹参素[18]，因此本实验药时曲线呈现双峰吸收现象。药动学结果显示：大鼠灌胃芪苈强心胶囊后，血浆中6种酚酸类成分的达峰时间（Tmax）在10～40min内，半衰期（t1/2）在3.34～8.38 h，呈现吸收快、消除亦快的特点。药动学参数血药达峰浓度（Cmax）和血药浓度-时间曲线下面积（AUC0-∞）能够评价药物的吸收程度和体内暴露情况。大鼠灌胃芪苈强心胶囊后，血浆中酚酸类活性成分的Cmax和AUC0-∞从大到小排序依次为丹酚酸B＞丹参素＞紫草酸＞迷迭香酸＞原儿茶酸＞丹酚酸A，其中丹酚酸B的Cmax（502 ng/mL）和AUC0-∞（980.47 h·ng/mL）最高，说明其吸收程度和体内暴露情况优于方中其他活性成分。既往研究报道丹酚酸B经大鼠口服后能够迅速吸收并转化成丹参素，因此丹参素在受试者体内具有较高的系统暴露水平[19-21]。但本研究中表明大鼠灌胃芪苈强心胶囊后，血浆中丹酚酸B的系统暴露水平明显高于其它成分，原因可能与芪苈强心胶囊中丹酚酸B的含量（3.987mg/g）较高有关[9]。另一方面，丹酚酸B对心肌梗死具有保护作用，并能够明显改善心肌缺血再灌注损伤，对心血管系统具有显著的保护作用[22]。另外，课题组前期对芪苈强心胶囊含量测定结果显示酚酸类成分的含量从大到小排序依次为[9]：丹酚酸B＞丹参素＞丹酚酸A＞迷迭香酸＞紫草酸＞原儿茶酸，而本研究中丹酚酸A的Cmax（8.96 ng/mL）和AUC0-∞（21.40 h·ng/mL）最低，其原因可能为丹酚酸A在正常机体内的吸收情况较差，或通过甲基化和葡萄糖醛酸化快速生成小分子代谢产物有关[23]。综上，本实验对芪苈强心胶囊中臣药丹参的6种酚酸类活性成分的药动学特征进行研究，阐述药物的体内过程，为进一步确定药效物质基础提供实验依据。