秉前环毛蚓蚓激酶的提取及活性研究初报

2019-08-26林佳艳王文文唐梅

南方农业·上旬 2019年7期

林佳艳　王文文　唐梅

摘要蚓激酶是从蚯蚓体内提取的一组具有激酶和纤溶酶活性的蛋白质，能够溶解血栓，具有很好的临床应用价值。试验采用硫酸铵粗提取的方法，从峨眉山大蚯蚓（秉前环毛蚓）体内提取蚓激酶粗提取物，测定其生物活性，并探讨pH值、金属离子及温度对粗提物酶活性的影响。试验结果表明：1）pH值、金属离子及温度对粗提物酶活性有影响。2）pH值在5～12，蚓激酶活性相对比较稳定，当pH=8时，酶活性达到最大值;3）Pb2+、Hg2+抑制酶活性;K+、Ca2+和Fe2+促进酶活性;4）当温度在60 ℃以下时，酶活性较高且稳定性好;大于80 ℃时几乎完全失活。

关键词峨眉山大蚯蚓;秉前环毛蚓;蚓激酶;酶活性;纤溶酶

中图分类号：Q814 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.19.017

蚯蚓，又名地龍，属环节动物门寡毛纲[1]。世界上蚯蚓大约有2 500种，入药史长达四千年之久[2]。在中国医药学历史上，蚯蚓可作为传统中药，具有降压、利尿、清热等作用。蚯蚓除作为传统中药外，还可从其体内提取活性物质，如蚓激酶、多种氨基酸等[3]。蚯蚓喜欢在潮湿阴暗、较疏松及腐殖质多的土壤中营穴居生活，通常昼伏夜出，能够有效地躲避天敌[4]。

日本美原恒等从粉正蚓（Lumbricus rubellus）体内分离出一种具有溶纤作用的粗提物，并命名为蚓激酶[5]。蚓激酶具有激酶和纤溶酶活性，有溶解血栓作用，是目前世界上极具开发价值的纤溶类药物。程牛亮[6]分离得到相对分子质量为36 000和29 000的两种纤溶酶组分，能够较好地溶解纤维蛋白及家兔血凝块。邓国宝等[7]发现蚓激酶具有良好的降低血糖、血脂功能。董强等[8]发现蚓激酶可用来治疗和预防缺血性脑血管疾病。

峨眉山大蚯蚓，学名为秉前环毛蚓（Pheretima praepinguis），是峨眉山的特有种，主要分布在峨眉山的龙门洞（海拔约600 m）至万年寺（海拔约1 000 m）[4]。峨眉山大蚯蚓肌肉很发达，伸缩能力强，可有效改善和净化土壤。本试验从峨眉山大蚯蚓体内提取蚓激酶粗提物，测定其生物活性，并探讨pH值、金属离子及温度对粗提物酶活性的影响，为研发蚓激酶类药物提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为峨眉山大蚯蚓（秉前环毛蚓），2017年7月在峨眉山报国寺、清音阁、万年寺和洪椿坪一带（海拔500～1 200 m）采得。峨眉山大蚯蚓先进行粗提，蚓激酶粗提物置-4 ℃恒温箱中保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 蚓激酶粗提物的提取

提取蚓激酶工艺流程为[9]：原材料蚯蚓→多次水洗→称重量→加入缓冲溶液→匀浆机匀浆→离心→取上清液加入硫酸铵→离心→上清液加入硫酸铵→高速离心→收集沉淀→透析去掉盐→冷冻干燥冻干→蚯蚓粗制品。

1.2.2 蚓激酶粗提物浓度测定

测定蚓激酶粗提物浓度，采用考马斯亮蓝染色法测定蚓激酶溶液在波长为595 nm下测定其吸光度值[10]，得出浓度。标准曲线方程为y=0.006 9x+0.002 1，系数R2=0.988 3。详见图1。

1.2.3 蚓激酶粗提物的活性测定

蚓激酶粗提物活性的测定采用酶解鸡血块方法[11]。

1.2.4 蚓激酶粗提物pH稳定性测定及最适pH值

蚓激酶粗提物pH稳定性测定及最适pH值参考周海等的方法[12]。

1.2.5 测定各种金属离子对蚓激酶粗提物活性的影响

测定各种金属离子对蚓激酶粗提物活性的影响参考谢德芳的方法[2]。

1.2.6 蚓激酶粗提物热稳定性以及最适温度的测定

蚓激酶粗提物热稳定性以及最适温度的测定参考邓志会的方法[13]。

2 结果与分析

2.1 蚓激酶粗提物的制备

本试验新鲜峨眉山大蚯蚓的总用量为875.65 g，通过盐析粗提、透析去盐、冷冻干燥后得到蚓激酶粗提物7.18 g，蚓激酶的产率为0.82%，蚓激酶产率较低。由图1可知，取1 mL蚓激酶液进行测定，得到吸光度值为0.365，由标准曲线方程可知蚓激酶液的浓度为52.6 μg·mL-1。

2.2 蚓激酶粗提物酶活性的检测

由表1可知，第3组上清液蛋白质含量较第一、二组含量高。在鸡血块被酶解后，所含可溶性蛋白质含量明显提高，由0.24%上升到0.62%。由此可知，蚓激酶粗提物具有酶活性，能够酶解鸡血块使其蛋白含量增加。

2.3 蚓激酶粗提物的pH稳定性测定

混合液放置一段时间，进行活性测定，结果如图2所示。当pH<3时，蚓激酶几乎失去活性;在pH在5～12，蚓激酶活性相对比较稳定;在pH=8时，酶活性达到最大值;虽然在pH>9后，酶活性虽有所下降，但其活性相对仍较高;可见，蚓激酶在碱性环境，其活性相对较强。

2.4 金属离子对蚓激酶的活性影响

由图3可知，K+、Ca2+和Fe2+能够提高蚓激酶活力;而Pb2+和Hg2+对酶活有抑制作用。金属离子作为酶的激活剂还是抑制剂，主要取决于金属离子与酶活性中心基团是否发生作用。若某一金属离子能与酶某一活性中心基团作用结合，抑制酶发挥正常作用，如重金属离子Pb2+、Hg2+就可以和酶活性中心的-SH作用而抑制酶活性。金属离子如K+、Ca2+和Fe2+等对酶活性就起促进作用。

2.5 蚓激酶粗提物的热稳定性及最适温度的测定

将蚓激酶粗提物放在不同温度水浴锅保温2 h后，测定蚓激酶活性。如图4所示，蚓激酶粗提物在温度60 ℃以下保温2 h，其酶活性相对稳定，没有显著变化;但温度高于60 ℃，蚓激酶活性发生变化，曲线呈下降趋势，且斜率相对较大，说明酶活性下降速率较快;当温度达到80 ℃以上时，蚓激酶几乎完全失去活性。由此可知，蚓激酶具有很好的温度稳定性，可以在常温下进行提取和储存。

3 结论与讨论

迟玉杰等[14]研究表明，蚓激酶在pH=8.0时的活性最高。蚓激酶的最适温度为57 ℃，热稳定性好;蚓激酶其化学本质是蛋白质，强酸强碱能够破坏蛋白质的稳定，使得蚓激酶失去了生物活性。

由试验可知，在偏碱性条件下，蚓激酶的活性相对较强，pH值在5～12时，蚓激酶的活性都较强;pH=8.0时，蚓激酶的活性最高;pH<3蚓激酶几乎完全失去活性。可见，蚓激酶具有较好的pH稳定性，能够较好地适应碱性环境，如肠道碱性环境。若将蚓激酶加工成肠制剂，蚓激酶在肠道中可以保持较高的活性，发挥作用时间长，但是如果位于胃液较强酸性（pH值一般在0.9～1.5）環境中，蚓激酶失去活性，不能正常发挥作用。

金属离子对蚓激酶的作用有所差别，K+、Ca2+和Fe2+能够增强蚓激酶活力，起着激活剂作用;而Pb2+和Hg2+抑制酶活性，起着抑制剂作用，与迟玉杰等[14]研究结果相似。

刘美艳等[15]研究证明，在蚓激酶活性不被破坏的条件下，通过较长时间水浴保温，蚓激酶活性仍能保持在50%以上。本试验也表明蚓激酶粗提物的热稳定性比较强，能够较好的适应温度的变化。因此，蚓激酶药剂在室温下能储存。

蚓激酶有溶解血栓和防止血栓形成等作用，其应用前景广阔，直接从蚯蚓中提取蚓激酶，量少且花费大，目前蚓激酶还没有基因工程产品，后期可以利用基因工程技术进行蚓激酶基因的转移及表达研究;为进一步研究纯化、研究构效的关系，在增强或保持其催化活性的前提下通过对其某些特定氨基酸残基的突变或是通过相关结构域的删除、增加或融合等手段，以期提高对纤维蛋白的选择性、提高对纤溶酶原激活剂、抑制剂的抗性，延长其在血液循环中的半衰期，导向溶栓、抗血栓形成等是今后蚓激酶的研究方向;同时为后期蚓激酶的开发和批量生产提供理论基础。

参考文献：

[1] 王承利，张贺，王洋.蚓激酶研究进展[J].沈阳部队医药，2010，23（3）：200-202.

[2] 谢德芳.蚓激酶的分离纯化、酶学性质及体外模拟消化的研究[D].武汉：武汉轻工大学，2013.

[3] 赵旭壮.蚯蚓中蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力研究[D].成都：西华大学，2012.

[4] 唐梅，龚明福，唐波.峨眉山大蚯蚓生活环境的特点及其生态分布研究[J].科技资讯，2014，12（29）：247，249.

[5] Mihara H， Sumi H， Akazawa T， et a1. Fibrinolytic enzyme ex-tracted from the earthworm l Jl Fhromb Haemostas， 1983， 50： 258-263.

[6] 程牛亮.蚓激酶活性研究进展[J].中国实验临床免疫学杂志，1996，8（2）：8-11.

[7] 邓国宝，刘媛莉，王石荣.蚓激酶对2型糖尿病胰岛素抵抗及TNA-a影响的临床研究[J].辽宁中医药大学学报，2007，9（3）：110-111.

[8] 董强，乔健，史郎峰，等.蚓激酶胶囊治疗脑梗死患者的疗效和安全性[J].中国新药杂志，2004（3）：257-260.

[9] 马闯，杨新力，杨丽萍，等.蚓激酶提取工艺的初步研究[J].山东食品发酵，2007（1）：3-4.

[10] 赵英永，戴云，崔秀明，等.考马斯亮蓝G-250染色法测定草乌中可溶性蛋白质含量[J].云南民族大学学报（自然科学版），2006（3）：235-237.

[11] 谢木林，章世元，王春维.蚓激酶粗提取条件的探讨[J].饲料博览，2010（3）：30-32.