香蕉根结线虫卵的分离与孵化试验初报

李春　赵东兴　张建春　李芹

摘   要   采用直接解剖分离法和粉碎筛分法分离香蕉根结线虫，并利用滤液和蒸馏水（对照）在室温和26 ℃恒温培养箱中培养，研究香蕉根结线虫卵的分离和孵化情况。结果表明：1）粉碎筛分法具有简单、快速的特点，能较快获取所需线虫卵的悬浮液;2）26 ℃恒温培养卵孵化率比室温条件下孵化率高，且用滤液培养的卵孵化率高于蒸馏水培养的孵化率。3）在26 ℃恒温条件下加入滤液和蒸馏水培养10 d，卵的孵化率分别为84.21%和58.36%;室温条件下培养10 d，线虫的孵化率分别为43.22%和27.55%。4）粉碎筛分法是一种较简单的从香蕉根中分离得到根结线虫卵的方法，且在26 ℃用滤液培养10 d能使多数线虫卵孵化。

关键词    香蕉;根结线虫卵;分离;孵化;粉碎筛分法

中图分类号：S432.4+5;S668.1    文献标志码：A    DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.19.012

香蕉根结线虫病（Meloidogyne incognita）是由根结线虫属（Meloidogyne spp.）的线虫引起的，是为害香蕉的重要病害之一，各香蕉种植区均有发生，发病率一般为20%～30%，严重的达60%以上。香蕉被线虫为害后，植株表现为叶黄、矮小，早衰，抽蕾困难，产量减少。有些蕉园由于根结线虫的影响，有一半以上的香蕉树不能结出有商品价值的果实[1-5]。根结线虫的侵染导致香蕉严重减产，极大地影响了香蕉产业的可持续发展[6-7]。

目前，国内外对香蕉根结线虫的研究主要集中在防治方面[8-13]，而对于香蕉根结线虫卵的分离与孵化研究较少，仅见刘志明等[14]研究了不同香蕉品种根渗出物对南方根结线虫卵孵化的影响，但未涉及线虫卵的分离。因此，有必要对香蕉根结线虫卵的分离以及卵的孵化进行研究。本试验采用直接解剖分离法和粉碎筛分法分离香蕉根结线虫，并利用滤液和蒸馏水对照在室温和26 ℃恒温培养箱中培养，计算卵的孵化率，以期为香蕉根结线虫的进一步研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器

显微镜、体视镜、3.5 cm培养皿、200目和500目标准分样筛。

1.1.2 材料

试验用香蕉根采自于云南省红河热带农业科学研究所香蕉种植基地。

1.2 试验方法

1.2.1 香蕉根结线虫卵的分离

1.2.1.1直接解剖分离法

将采集的香蕉根洗净，选取带根结病根在体视镜下直接挑取线虫卵粒。

1.2.1.2粉碎筛分法

将采集的香蕉根洗净，收集带根结病根，将病根剪成0.5～1.0 cm大小，置于植物粉碎机中粉碎，过滤，收集500目筛子中的卵，离心后配成300个卵/mL的根结线虫卵悬浮液。

1.2.2 根结线虫卵的孵化

在无菌培养皿（直径为3.5 cm）中加入根结线虫卵悬浮液0.2 mL，即线虫卵约60个，再加入根结滤液0.8 mL，分别置于室温和26 ℃恒温培养箱中培养，以蒸馏水为对照，每个处理重复3次。在0， 2， 4， 6， 8， 10 d时于显微镜下观察培养皿内孵化出的二龄幼虫（J2）数，并计算线虫孵化率。以上试验重复3次。

线虫孵化率（%）=孵化线虫数/线虫卵数×100

2 结果与分析

2.1 香蕉根结线虫卵的分离

根结线虫卵的分离方法有直接解剖分离法、粉碎筛分法等。试验对比了直接解剖分离法和粉碎筛分法2种方法分离线虫卵的效果。直接解剖分离法能获得较纯净的线虫卵，但需在体视显微镜下操作，对操作者的技术熟练程度要求较大，且耗费大量的时间。通过查阅大量的文献，参考王鑫鹏等[15]的办法，将香蕉根洗净，收集带根结病根，将病根剪成0.5～1.0 cm大小，置于植物粉碎机中粉碎，过滤，收集500目筛子中的卵，离心后得到大量的线虫卵。通过此法可简单、快速分离得到试验所需的线虫卵。因此，试验所需的线虫卵均为此法获得。

2.2 不同条件下香蕉根结线虫卵的孵化率

根结线虫具有親水性。在试验的前期，发现根结线虫在滤液中浸泡8 d后，还有大量线虫活着，并且随着时间增加，二龄线虫的数量呈增加趋势。因此，试验研究滤液、培养温度及蒸馏水培养对根结线虫卵的孵化率影响，不同培养条件下香蕉根结线虫卵的孵化率见表1。

从表1中可看出，在室温条件下，加入滤液的线虫卵孵化率10 d后达到43.22%，而蒸馏水对照的线虫孵化率为27.35%;从时间上来看，与蒸馏水对照处理相比，在所记录的各个时间，加入滤液的线虫孵化率均比对照处理的孵化率高。

在26 ℃恒温培养箱中培养，加入滤液线虫卵孵化率10 d后达到84.21%，而蒸馏水对照的线虫孵化率为58.36%;另外，与蒸馏水对照处理相比，在所记录的各个时间，加入滤液的线虫孵化率均比对照处理的孵化率高。

通过表1中的数据可以看出，恒温培养的卵孵化率比室温培养的卵孵化率高，这可能是因为温度对卵的孵化有影响。南方根结线虫是云南省河口地区香蕉根结线虫的优势种群[16-17]，而南方根结线虫的适宜孵化温度为25～35 ℃。另外，加入滤液后，在26 ℃恒温培养10 d，线虫卵孵化率为84.21%，卵孵化率高出对照的25.85%，这是因为滤液是由香蕉根粉碎后冲洗过滤所得，里面可能中含有线虫发育需要的营养成分。

3 小结与讨论

试验通过对比了直接解剖分离法和粉碎筛分法分离香蕉病根中根结线虫的效果，结果为粉碎筛分法具有简单、快速的特点，能较快获取所需线虫卵的悬浮液，可用于香蕉病根中线虫卵的分离与富集。

试验分别研究了室温培养和26 ℃恒温培养条件下用滤液培养和蒸馏水培养线虫卵的孵化率。结果表明，在室温条件或恒温条件下，用滤液培养的卵孵化率高于蒸馏水培养的孵化率，室温条件下培养10 d，线虫的孵化率分别为43.22%和27.55%;26 ℃恒温培养10 d，线虫的孵化率分别为84.21%和58.36%。这可能是因为试验是在2018年11月至2019年1月进行，空气温度较低，未达到线虫卵的适宜孵化温度造成的。据报道，云南省河口地区香蕉根结线虫的优势种群为南方根结线虫[16]，而离体条件下，南方根结线虫的卵适宜孵化温度为25～35 ℃，最适温度为27 ℃和26 ℃[17]。另外，滤液培养的卵孵化率高于蒸馏水培养的孵化率，有可能是滤液由香蕉根粉碎后冲洗过滤所得，里面可能中含有线虫发育需要的营养成分。

试验通过研究香蕉根结线虫的分离和培养，得到了简单快速的线虫卵分离和人工孵化方法，为香蕉根结线虫的进一步研究提供了基础。

参考文献：

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（责任编辑：敬廷桃）