发酵剂添加量和成熟时间对牦牛乳硬质干酪脂肪氧化的影响

2019-08-26马欢梁琪宋雪梅张炎

食品与发酵工业 2019年15期

马欢，梁琪*，宋雪梅，张炎

1(甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州，730070) 2(甘肃省功能乳品工程实验室(甘肃农业大学)，甘肃兰州，730070)

牦牛是生活在青藏高原和邻近高地的一种稀有物种，可为当地牧民提供优质的肉、乳等生活原料[1-2]。与普通牛乳相比，牦牛乳的蛋白质、乳糖、脂肪和矿物质营养含量更高[3]。干酪是世界上被广泛消费的发酵乳制品，具有很高的营养价值[4]，联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO)和世界卫生组织(World Health Organization, WHO)将干酪定义为：以牛乳、奶油、部分脱脂乳、酪乳或这些产品的混合物为原料，经凝乳并分离乳清而制得的新鲜或发酵成熟的乳制品[5]。牦牛乳硬质干酪营养丰富，脂肪和蛋白质含量相当于新鲜乳的10倍左右，每100 g干酪含钙720 mg，是牛乳的14倍，且钙磷比适中，是补钙的最佳食品[6-7]。

干酪中的发酵剂是指在干酪生产和成熟期间，可促进干酪发酵与成熟的特定微生物培养物。干酪生产中所用的发酵剂可分为霉菌发酵剂和细菌发酵剂2类，但霉菌发酵剂的应用范围没有细菌发酵剂广泛。细菌发酵剂以乳酸菌为主，包括乳酸乳球菌乳脂亚种和乳酸亚种、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌等。乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcuslactissubs.Cremoris)和乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactissubs.Lactis)这2个亚种在乳制品中作为嗜温发酵剂被广泛使用[8]。

干酪中的脂肪不仅具有营养价值，而且在干酪的质地、风味和香气的发展中发挥重要作用，赋予其感官和功能特征[9]。脂肪的氧化降解是指甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯在脂酶作用下代谢产生游离脂肪酸和风味前体物质的过程[10]，是干酪成熟过程中必经的一个动态而又复杂的生物化学变化[11]。

发酵剂的种类及添加量，在干酪加工过程中有着重要的作用[12]。研究表明，发酵剂可在干酪中大量残留，并在干酪成熟期间释放大量的脂酶，使脂肪氧化降解，从而形成干酪特有的风味[13]。目前，国外关于山羊干酪[14]、再制干酪[15]、菲达干酪[16]和不同乳脂含量山羊干酪[17]中脂肪氧化的研究报道较多，但关于发酵剂添加量对牦牛乳硬质干酪成熟期间脂肪氧化影响的研究还未见报道。因此，本试验通过对牦牛乳硬质干酪的理化指标和氧化指标进行研究，分析发酵剂添加量和成熟时间与干酪理化性质和脂肪氧化情况的关系，以期找到干酪中脂肪氧化的动态变化规律。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜牦牛乳，采自甘肃天祝县抓喜秀龙乡；嗜温发酵剂、凝乳酶、无水Na2SO4、无水乙醚、NaCl、CaCl2、NaOH、Na2S2O3、2, 4-二硝基苯肼、硫代巴比妥酸、异辛烷、三氯甲烷、甲醇、KI、三氯乙酸、乙醇、苯、冰乙酸、三氟化硼甲醇络合物,所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

干酪槽，自制；723型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；PHS-3C 精密pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂；AL204 分析天平，梅特勒-托利多上海仪器有限公司；BCD-539WF电冰箱，青岛海尔股份有限公司；电热鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司；TGL-20M高速台式冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；XHF-D高速分散器，宁波新芝生物科技股份有限公司；HWS26-电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；真空包装机，温州市大江真空包装机械有限公司；KQ-250B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛乳硬质干酪加工工艺流程

原料乳→检验→巴氏杀菌(63 ℃，30 min)→冷却(35 ℃)→添加发酵剂(1%、2%、3%)→添加CaCl2(0.3 g/L)→添加凝乳酶(0.67%)→凝乳→切割、排乳清→二次加热(45 ℃)→排乳清→搅拌、加盐(凝块的2%)→堆酿(2 h)→压榨成型→真空包装→成熟

1.3.2 牦牛乳硬质干酪出品率测定[18]

将牦牛乳硬质干酪压榨完后称其质量，根据干酪水分含量与干酪质量计算干酪出品率(公式1)：

(1)

为了更加准确地比较3种牦牛乳硬质干酪的出品率，将干酪的实测出品率校正到水分含量为45%时再进行计算，如公式2。

校正出品率/%=

(2)

1.3.3 牦牛乳硬质干酪中水分含量的测定

参考GB 5009.3—2016中的直接干燥法进行。

1.3.4 干酪中NaCl含量测定[19]

将准确称取的2 g干酪样品置于250 mL锥形瓶内，加入10 mL蒸馏水和0.05 mol/L的AgNO3溶液25 mL，在80 ℃的水浴中加热至试样溶解后加入10 mL浓H2SO4，搅拌7～10 min，待溶液澄清后，过滤，除去脂肪，向滤液中加入2 mL硫酸亚铁铵指示剂和10 mL蒸馏水，用0.05 mol/L的硫氰酸钾溶液滴定至橘红色，15 s内不变色即可。同时，进行空白试验，计算NaCl的含量。结果计算如公式(3)：

(3)

式中：m,干酪样品质量,g；V,消耗硫氰酸钾的体积,mL；V0,空白消耗硫氰酸钾的体积,mL；c,硫氰酸钾的摩尔浓度,mol/L；0.002 92,1 mL 0.05 mol/L硫氰酸钾溶液相当的NaCl的质量。

1.3.5 干酪中pH值的测定[20]

称取2 g干酪样品，将干酪和蒸馏水以1∶10的比例混合，研磨匀浆后，用pH计测定浆液pH值。

1.3.6 干酪成熟过程中干酪中酸度值(acidity value, ADV)值的测定[21]

称取5～10 g干酪样品置于烧杯中，加入50 mL石油醚与乙醇混合液(2∶1)匀浆，过滤，取滤液，加入少许酚酞指示剂，用0.1 mol/L氢氧化钾甲醇溶液进行滴定，出现玫红色，15 s内不变色即可。结果计算如公式(4)：

(4)

式中：V,滴定所用体积,mL；c,氢氧化钾乙醇溶液的摩尔浓度,mol/L；m,干酪样品的质量,g。

1.3.7 干酪中过氧化值(peroxide value, POV)值的测定

参考GB 5009.227—2016中过氧化值的测定方法，称取2～5 g干酪样品置于250 mL碘量瓶中，加入50 mL乙酸-异辛烷溶液，匀浆混匀试样。加入0.5 mL饱和KI溶液，盖上盖子摇动1 min±1 s，然后放置暗处3 min左右，取出加入30 mL蒸馏水后立即加入0.5 mL淀粉溶液，滴定至蓝色消失，即为终点。同时进行空白试验。用过氧化物的毫克当量数表示时，结果计算如公(5)：

(5)

式中：V,试样滴定消耗硫代硫酸钠溶液的体积,mL；V0,空白滴定消耗硫代硫酸钠溶液的体积,mL；c,硫代硫酸钠标准滴定溶液的浓度,mol/L；m,试样质量,g；1 000,换算系数。

1.3.8 干酪中羰基价(carbonyl value, CV)的测定

参考GB 5009.230—2016中羰基价(CV)的测定方法，称取0.025～0.5 g试样，置于25 mL具塞试管中，加5 mL苯溶解油样，加3 mL三氯乙酸溶液及5 mL 2,4-二硝基苯肼溶液，仔细振摇混匀。在60 ℃水浴中加热30 min，反应后取出用流水冷却至室温，沿试管壁缓慢加入10 mL KOH-乙醇溶液，使成为二液层，旋涡振荡混匀后，放置10 min。以1 cm比色杯，用试剂空白调节零点，于波长440 nm处测吸光度。按公式(6)计算：

(6)

式中：X,试样的羰基价(以油脂计),meq/kg；A,测定时样液吸光度；854,各种醛的毫克当量吸光系数的平均值；m,油样质量，g；1 000,换算系数。

1.3.9 干酪中硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid value, TBA)的测定

参考ARYEE等[22]和SALIH等[23]的方法并略加修改。称取10 g试样，加入50 mL 7.5%的三氯乙酸混合液，振荡30 min，双层滤纸过滤2次。取5 mL上清液加入5 mL 0.02 mol/L的TBA溶液，沸水浴中保温40 min，取出冷却1 h后，以16 000 r/min离心5 min，取8 mL上清液加5 mL氯仿摇匀，静置分层后取上清液，分别在532 nm和600 nm处比色，记录吸光度并计算硫代巴比妥酸值。按公式(7)计算：

TBA(mg/100g)=(A532-A600)×72.06×10/155

(7)

式中：三氯乙酸混合液;7.5 g三氯乙酸,0.1 g EDTA定容至100 mL；0.02 mol/L TBA溶液，0.288 3 g TBA定容至100 mL。

1.4 数据统计与处理

试验每个处理重复3次，采用SPSS 17.0软件进行差异显著性分析和Pearson相关性分析，Origin 7.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 牦牛乳硬质干酪常规理化指标

2.1.1 发酵剂添加量对牦牛乳硬质干酪出品率的影响

通过干酪出品率可以了解干酪的生产效能并反映工艺参数是否经济合理[24]。由表1可知，发酵剂添加量对实测出品率和校正出品率均有极显著的影响(P<0.01)，发酵剂质量分数为1%、2%和3%时，干酪的校正出品率分别为18.9%、19.4%和18.6%。牦牛乳硬质干酪的出品率随发酵剂添加量的增加呈现出先增大后降低的趋势，当发酵剂质量分数为2%时，干酪实测出品率最高，达19.4%，这是由于发酵剂质量分数为1%时，产酸较慢，乳清排出率低，造成干酪出品率下降；发酵剂质量分数为3%时，产酸速度快，产酸量增大，部分蛋白质被分解成小分子肽类物质溶于乳清，造成了干酪的损失。

表1 发酵剂添加量对干酪出品率的影响

注：不同字母表示发酵剂添加量对其差异显著(P<0.05)。

2.1.2 发酵剂添加量和成熟时间对牦牛乳硬质干酪pH值的影响

已有研究表明，随着NaCl含量的升高，干酪的pH值会随之改变[25]。pH值过低，会导致干酪过硬、过脆，pH值过高，会导致干酪过软、失形[26]。由图1可知，发酵剂质量分数为1%～3%的3种牦牛乳硬质干酪的起始pH值之间差异显著(P<0.05)，但其在成熟90 d的过程中变化趋势相同，均呈现先降低后增加的趋势，成熟时间为30 d时pH值最小，分别为5.59、5.47和5.38，这是因为成熟前期，干酪中的乳糖转化为乳酸，产生大量的H+，导致pH值下降，成熟后期乳糖慢慢耗尽，产酸速度减慢，并由于蛋白质的分解，使得干酪的pH值增加[27]。发酵剂添加量对干酪pH值有显著性影响(P<0.05)，发酵剂质量分数为1%和3%时成熟时间对pH值的影响差异极显著(P<0.01)，但发酵剂质量分数为2%时，成熟时间对pH值的差异显著(P<0.05)。随发酵剂添加量的增加干酪的pH值呈现降低的趋势，90 d时，3%和2%比1%发酵剂质量分数干酪的pH值分别降低了3.4%和1.6%。

图1 发酵剂添加量和成熟时间对牦牛乳硬质干酪pH值的影响

Fig.1 Effect of the amount of starter and ripening time on the pH value of yak milk hard cheese

注：不同小写字母表示发酵剂添加量对其差异显著(P < 0.05)；不同大写字母表示成熟时间对其差异显著(P < 0.05)。下同。

2.1.3 发酵剂添加量和成熟时间对牦牛乳硬质干酪水分含量的影响

由图2可知，成熟时间为0 d时，发酵剂质量分数为1%的水分含量与2%和3%之间存在显著性差异(P<0.05)。发酵剂质量分数为1%～3%的3种干酪在成熟90 d的过程中变化趋势相同，均呈下降的趋势，分别降低了5.5%、5.1%、4.6%。成熟时间对发酵剂质量分数为1%的水分含量影响差异极显著(P<0.01)。干酪中水分含量随发酵剂添加量的增加而增加，90 d时3%和2%比1 %发酵剂质量分数干酪的水分含量分别高1.5%和1.3%，3%发酵剂质量分数的水分含量显著高于1%发酵剂质量分数干酪中的水分含量(P<0.05)。

图2 发酵剂添加量和成熟时间对牦牛乳硬质干酪水分含量的影响

Fig.2 Effect of the amount of starter and ripening time on the moisture content of yak milk cheese

2.1.4 发酵剂添加量和成熟时间对牦牛乳硬质干酪NaCl含量的影响

图3 发酵剂添加量和成熟时间对牦牛乳硬质干酪NaCl含量的影响

Fig.3 Effect of the amount of starter and ripening time on the NaCl content of yak milk hard cheese

干酪中添加无机盐的目的是改善风味，并能促进乳清的排放、控制干酪的水分含量[28]。由图3可以看出，成熟时间为0和60 d时，发酵剂质量分数为1%～3%的3种牦牛乳硬质干酪的NaCl含量之间差异极显著(P<0.01)，0 d时3种干酪的NaCl含量分别为0.95%、0.80%、0.56%；60 d时NaCl含量分别为1.52%、1.17%、0.97%。随发酵剂质量分数的增加，3种干酪的NaCl含量呈现下降的趋势，90 d时3种干酪的NaCl含量分别为1.66%、1.47%、1.22%；3%比1%发酵剂质量分数干酪的NaCl含量低26.5%。在成熟90 d的过程中3种干酪的变化趋势相同，均呈现增加的趋势，发酵剂质量分数从1%～3%的干酪中NaCl含量分别增加了0.74%、0.67%、0.66%。发酵剂添加量和成熟时间对干酪NaCl含量的影响差异显著(P<0.05)。

2.2 牦牛乳硬质干酪脂肪氧化降解程度

2.2.1 发酵剂添加量和成熟时间对牦牛乳硬质干酪ADV值的影响

干酪的酸度值主要反映了干酪降解为游离脂肪酸的情况，是衡量乳及乳制品脂肪降解程度的一项指标[21]。由图4得，成熟时间为0 d时，发酵剂添加量对3种牦牛乳硬质干酪的ADV值没有显著性影响(P>0.05)，但成熟时间为30、60、90 d时，发酵剂添加量对干酪ADV值的影响极显著(P<0.01)。成熟时间对发酵剂质量分数为2%和3%时干酪的ADV值影响显著(P<0.05)。在成熟90 d的过程中3种干酪(1%～3%)的变化趋势相同，均呈现增加的趋势，在成熟时间为90 d时ADV值分别为4.23、5.22、5.73 mg/g，是成熟时间为0 d时的2.21、2.58、2.75倍。发酵剂质量分数为1%的干酪在成熟30～60 d，ADV值增加了6.84%，增加缓慢，但在随后的60～90 d，增加了28.96%。发酵剂质量分数为3%的干酪在成熟90 d的过程中，ADV值增加程度高，90 d时的ADV值是0 d时ADV值的2.75倍。说明增大发酵剂的添加量，干酪中脂肪氧化降解程度会随之增加。3种干酪随着牦牛乳硬质干酪成熟时间的延长，ADV值逐渐增大，表明干酪在成熟期间脂肪的氧化降解持续进行。

图4 发酵剂添加量和成熟时间对牦牛乳硬质干酪ADV值的影响

Fig.4 Effect of the amount of starter and ripening time on the ADV value of yak milk hard cheese

2.2.2 发酵剂添加量和成熟时间对牦牛乳硬质干酪POV值的影响

POV是测定初级氧化产物-过氧化物含量的理化指标，能够反映脂质发生一级氧化的程度。它主要是脂肪降解产生的不饱和脂肪酸中的双键与环境中的氧气发生氧化反应，形成一种中间氧化产物[29]。

由图5可知，成熟时间为0 d时，发酵剂添加量对POV值没有显著性影响(P>0.05)，但随着成熟时间的延长，发酵剂添加量对POV值的影响极显著(P<0.01)。3种干酪的POV值随发酵剂添加量的增加而增加，90 d时，3%比1%发酵剂质量分数干酪的POV值增加了50%。说明高发酵剂添加量可促进牦牛乳硬干酪一级氧化产物的产生。在成熟90 d的过程中3种干酪的变化趋势相同，均呈现增加后降低的趋势。在成熟60 d时3种干酪的POV值均为最大值，分别为1.12、1.37、1.63 meq/kg。在成熟时间90 d时，POV值显著降低(P<0.05)，分别为0.98、1.2、1.47 meq/kg，比60 d时降低了12.50%、8.76%、9.82%。这是由于过氧化物只是脂肪氧化的初级氧化产物，它的含量决定于生成量和降解量的比率[30]，表明成熟时间可能会使初级氧化产物部分分解，从而降低了干酪中的POV值。当脂肪降解产生的一级氧化物与消耗一级氧化产物产生的小分子物质相平衡时，POV值趋于平衡。

图5 发酵剂添加量和成熟时间对牦牛乳硬质干酪POV值的影响

Fig.5 Effect of the amount of starter and ripening time on the POV value of yak milk hard cheese

2.2.3 发酵剂添加量和成熟时间对牦牛乳硬质干酪CV值的影响

CV反映了干酪在成熟过程中脂肪氧化形成羰基化合物的含量，也是表示脂肪氧化程度的1个重要指标[31]。由图6可以看出，3种牦牛乳硬质干酪在成熟时间为0 d时，发酵剂添加量对干酪的CV值影响不显著(P>0.05)，其值分别为0.18、0.20、0.22 meq/kg。但随着成熟时间的延长，发酵剂添加量对CV值的影响极显著(P<0.01)，并随发酵剂添加量的增加，CV值随之增加。90 d时，3%发酵剂添加量的CV值是1%时的1.45倍。在成熟90 d的过程中3种干酪的变化趋势相同，均呈现增加的趋势，且成熟时间对CV值的影响极显著(P<0.01)。在整个成熟过程中3种干酪的CV值分别增加了0.82、1.1、1.29 meq/kg。总之，羰基价总体呈上升趋势，说明醛、酮、有机酸等小分子羰基化合物不断积累，脂肪氧化程度不断增加。

图6 发酵剂添加量和成熟时间对牦牛乳硬质干酪CV值的影响

Fig.6 Effect of the amount of starter and ripening time on the CV value of yak milk hard cheese

2.2.4 发酵剂添加量和成熟时间对牦牛乳硬质干酪TBA值的影响

TBA反映了脂肪发生二级氧化的程度，表明脂肪通过氧化作用生成过氧化物后在氢氧化物的作用下进一步氧化降解生成分子量更小的醛、酸之类的化合物[32]。

图7 发酵剂添加量和成熟时间对牦牛乳硬质干酪TBA值的影响

Fig.7 Effect of the amount of starter and ripening time on the TBA value of yak milk hard cheese

由图7可知，3种牦牛乳硬质干酪中，发酵剂添加量和成熟时间均对干酪中TBA值有极显著性的影响(P<0.01)。在成熟90 d的过程中3种干酪的变化趋势相同，均呈现增加的趋势，0 d时，干酪的TBA值分别为0.05、0.08、0.09 mg/kg，成熟90 d时，TBA值分别为0.18、0.20、0.22 mg/kg，分别增加0.13、0.12、0.13 mg/kg。3种干酪在成熟0～60 d的过程中，TBA值增加迅速，但在60～90 d的成熟过程中，TBA值的增加缓慢。随发酵剂添加量的增加，3种干酪的TBA值随之增加，发酵剂质量分数为3%干酪中的TBA值显著高于1%干酪中的TBA值(P<0.05)。90 d时3%发酵剂质量分数干酪的TBA值是1%时的1.22倍；是2%时的1.10倍。表明提高发酵剂添加量能促进次级氧化产物的产生。

2.3 相关性分析

由表2可知，成熟时间对干酪中NaCl含量、ADV值、CV值和TBA值具有极强的正相关性，相关系数分别为0.81、0.92、0.91、0.94，且相关性极显著(P<0.01)；对干酪中POV值具有强的正相关性(R=0.74)，且相关性极显著(P<0.01)；对水分含量有强的负相关性(R=-0.68)，且相关性显著(P<0.05)；但对干酪的pH值不具有相关性。