五味子乙素对缺血诱导人牙髓细胞的影响及作用机制研究

布 斐 苗玉珠

（阳谷县人民医院口腔科，山东 聊城 252300）

五味子乙素（schisandrin B，Sch B）是从中药五味子中提取得到的天然化合物之一，其具有抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡的作用[1-3]。可以增加细胞内抗氧化剂的含量，增强各种抗氧化酶的活性，同时可以增强线粒体的功能和结构的完整性，对细胞损伤均有一定的保护作用[4-8]。但是五味子乙素对人牙髓细胞的影响及作用机制尚无定论。本研究通过LPS对体外培养的牙髓细胞增殖、碱性磷酸酶活性以及FAK、ERK、Akt表达的影响，旨在通过FAK/ERK/Akt信号通路探讨脂多糖（LPS）对缺血诱导人牙髓细胞的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料。试剂：牙髓细胞是选取25岁以下因正畸原因拔出无病变牙的患者的牙髓组织；五味子乙素（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号W-001-500）；MTT、鼠抗人波形蛋白、鼠抗人角蛋白抗体一抗、二抗均购自美国Signal公司；逆转录试剂盒购自TransGen公司；RTPCR试剂盒购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，其他试剂均为化学分析纯。

1.2 牙髓细胞的培养与鉴定：收集25岁以下因正畸原因拔出无病变牙的患者的牙髓组织，无菌条件下将其剪成1 mm×1 mm×1 mm的小块，置于含有15%FBS H-DMEM培养液的培养瓶中，在条件为37 ℃、含有5% CO2的培养箱中培养，用倒置显微镜观察牙髓细胞的形态及生长情况；细胞生长融合至80%～90%的时候，采用0.25%的胰蛋白酶消化并传代。选取第3～5代牙髓细胞进行化学染色鉴定

1.3 实验分组：选取生长状态良好的第3～5代牙髓细胞，以5×104个/mL的密度将其接种于带有细胞盖玻片的48孔板中，在条件为37 ℃、含有5%CO2的培养箱中培养3～5 d，每孔体积为500 μL。待细胞贴壁后将其分为6组，药物组分别加入0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L的五味子乙素，空白对照组不添加任何诱导剂。

1.4 检测指标

1.4.1 MTT法检测各组细胞增殖率：采用MTT法检测五味子乙素对牙髓细胞增殖率的影响。选取生长状态良好的第3～5代牙髓细胞，以5×104个/mL的密度将其接种于带有细胞盖玻片的48孔板中，在条件为37 ℃、含有5% CO2的培养箱中培养3～5 d，每孔体积为500 μL，药物组的五味子乙素的浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L，同时以等体积H-DMEM培养液的培养液作为空白对照组，各组重复3孔。收集五味子乙素处理48 h后的各组细胞，更换无血清培养基培养12 h，使细胞周期同步化。离心收集细胞，沿壁管缓缓加入预冷的70%的乙醇，固定过夜。加入少量PBS洗涤，1000 r/min离心5 min，去乙醇液，洗2遍，再加入0.5 mL的PBS重悬细胞，加入PI和RNasea至终浓度为50 μg/mL，室温避光孵育30 min，区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞、坏死细胞，采用流式细胞仪分析细胞凋亡的情况，得到4个象限组成的细胞直方图，一式3份。

1.4.2 RT-PCR检测牙髓细胞中ALP、DSPP、HtrA1、TGF-β1mRNA的表达量：选取生长状态良好的第3～5代牙髓细胞，以5×104个/mL的密度将其接种于带有细胞盖玻片的48孔板中，在条件为37 ℃、含有5%CO2的培养箱中培养3～5 d，每孔体积为500 μL，加入含有15%FBS H-DMEM培养液的培养瓶中培养24 h，药物组的五味子乙素的浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L，同时以等体积H-DMEM培养液的培养液作为空白对照组，各组重复3孔。提取细胞的总RNA，按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，将cDNA置于-20 ℃中备用。反应条件如下：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃反应60 s，共进行40个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃反应5 min，每组进行3次独立测定，图像分析仪扫描凝胶密度，分析得到mRNA的相对含量。

1.4.3 Western blot检测牙髓细胞中FAK、ERK、AKT的表达：采用western blot（WB）检测不同浓度五味子乙素对牙髓细胞中FAK、ERK、AKT的表达的影响。

1.5 统计学分析：应用SPSS19.0软件对数据进行分析，结果用s）表示，使用单因素方差分析或t检验对不同分组数据进行比较，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 牙髓细胞形态观察及鉴定：细胞培养5 d后可以发现原代细胞从牙髓组织周围爬出，细胞生长状态良好，呈现长梭形漩涡状排列，进行传代后的细胞状态比较稳定。化学染色鉴定结果发现，传代后的细胞波形蛋白染色结果显示阳性，角蛋白染色结果显示阴性，结果说明此细胞来源于中胚层，具有牙髓细胞的生物学特性。

2.2 五味子乙素对细胞增殖率的影响：结果显示，不同浓度的五味子乙素分别处理牙髓细胞24、48、72 h后，各药物组细胞增殖率均高于无药物组（P<0.01），牙髓细胞的增殖率随着五味子乙素浓度的增加以及药物作用时间的延长呈现逐渐增强的趋势，且与药物浓度和时间呈现一定的依赖性。见表1。

表1 五味子乙素对细胞增殖率的影响

表1 五味子乙素对细胞增殖率的影响

注：与无药物组相比，**P<0.01

处理时间 24 h(%) 48 h(%) 72 h(%)0 μmol/L 0.0±0.00 0.0±0.00 0.0±0.00 0.625 μmol/L 18.83±5.74 ** 23.97±4.87 ** 29.76±5.33 **1.25 μmol/L 26.73±3.88 ** 36.26±3.90 ** 38.59±4.02 **2.5 μmol/L 34.65±4.62 ** 53.23±4.36 ** 66.92±3.96 **5 μmol/L 62.51±5.57 ** 76.68±7.27 ** 86.72±9.37 **10 μmol/L 82.64±8.56 ** 88.67±7.78 ** 89.56±8.39 **P值 <0.01 <0.01 <0.01

2.3 五味子乙素对细胞凋亡的影响：与空白对照组相比，不同浓度的五味子乙素处理牙髓细胞后，各药物组细胞的总凋亡率明显下降（P<0.01），且与药物浓度呈现一定的依赖性，差异具有统计学意义。

2.4 五味子乙素对牙髓细胞中ALP、DSPP、HtrA1、TGF-β1mRNA相对表达量的影响：不同浓度五味子乙素处理牙髓细胞后，药物组细胞中的ALP、DSPP、TGF-β1mRNA相对表达量均高于空白对照组（P<0.05和P<0.01），且与药物浓度呈现一定的依赖性，差异具有统计学意义；HtrA1的mRNA相对表达量虽然也高于空白对照组，但是与五味子乙素的药物浓度的优势不显著。

2.5 五味子乙素对牙髓细胞中FAK、ERK、AKT表达的影响：Wstern blot结果显示，不同浓度五味子乙素处理牙髓细胞后，药物组细胞中的FAK、ERK、AKT的表达显著高于空白对照组（P<0.05和P<0.01），且与药物浓度呈现一定的依赖性，差异具有统计学意义。

3 讨 论

研究发现，五味子乙素具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等的作用，能够抑制癌细胞增殖和转移、抑制神经细胞凋亡，改善阿尔茨海默症小鼠的学习记忆能力、还可以抑制肾小管上皮细胞凋亡[4-5]。但是五味子乙素对缺血诱导的人牙髓细胞的增殖、凋亡等的影响以及其可能的作用机制研究报道较少。本研究通过FAK/ERK/AKT信号通路探讨五味子乙素对缺血诱导人牙髓细胞的影响及作用机制，研究结果发现，不同浓度五味子乙素处理牙髓细胞后，随着五味子乙素浓度的增加牙髓细胞的增殖率呈现上升趋势，而牙髓细胞凋亡率明显下降，药物组细胞中的FAK、ERK、AKT的表达显著高于空白对照组，且与药物浓度呈现一定的依赖性。

细胞的增殖和凋亡一直是一种平衡状态存在于机体内，这种平衡一旦被打破就会引起一些病变的发生。细胞内的基因与细胞凋亡的发生发展有着直接的关系，然而细胞外的因素主要是可以通过一些信号传导因子作用于细胞内的金银，从而间接地影响了细胞的凋亡和增殖，许多信号通路参与了牙髓细胞的发生发展过程[6]。FAK作为一种蛋白质底物，是细胞增殖、迁移和凋亡的主要信号介质，研究发现，FAK对人牙髓细胞的细胞骨架组织有一定的影响[7-8]，因此，五味子乙素可能通过激活FAK信号来调节细胞骨架元素的动态变形和细胞凋亡。AKT是FAK下游靶点，在五味子乙素的作用下，由于FAK信号被激活引起ERK/AKT等下游信号被转导[9]]。在本研究结果发现五味子乙素可以使牙髓细胞中FAK、ERK、AKT的表达增强。