东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)利用有机磷增殖研究

肖宇梅，徐雯钦，苏玉萍，2*，张立香，佘晨兴，廖福萍

(1.福建师范大学环境科学与工程学院，福建 福州 350007；2.福建省污染控制和资源循环重点实验室，福建 福州 350007)

随着我国对海洋开发力度的增大，海洋的生态环境和资源受到了严峻的考验，海洋经济的发展也受其影响。随之引发的赤潮发生的频率和规模也呈现上升趋势。据统计，我国近海海域2001—2013年间引发赤潮的种类中以甲藻门为优势种的有27种，次之以硅藻门为优势种的有20种，其他如金藻门、蓝藻门、黄藻门等，共60种[1]。东海近海海域已成为我国赤潮高发区之一，东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)也已成为该海域赤潮的优势种[2]之一。相关数据显示，2001—2013年东海原甲藻赤潮在我国每年均有爆发，其中2013年作为第一优势种引发赤潮多达16次[1]。东海原甲藻属于甲藻纲，原甲藻目，原甲藻科，原甲藻属，主要在东海长江口、浙江近海至福建沿岸海域引发赤潮[3-4]。福建省是我国赤潮频发的省份之一。据统计，福建省每年平均发生赤潮16.1起[5]。2013—2017年东海原甲藻赤潮共12起。东海原甲藻已成为海洋研究工作者密切关注的一个藻种，探讨东海原甲藻赤潮的形成机制、预警应急以及藻种生长与环境因子的关系等已成为研究热点。

磷(Phosphorus，P)是微藻生长的必需营养元素之一，也是大多数代谢结构和功能所必需的元素[6]。海洋中的磷主要以溶解性无机磷(Dissolved inorganic phosphorus，DIP)和溶解性有机磷(Dissolved organic phosphorus，DOP)存在，且因DIP在水生系统中含量较低而通常成为浮游植物生长的第一个限制因素[7-8]。Zhang等研究发现东海原甲藻对DIP限制表现出积极的生理和转录反应，DIP的限制影响东海原甲藻的生长速率[9]，同时也在剧毒卡尔藻(Karlodiniumveneficum)[10]和米氏凯轮藻(Kareniamikimotoi)中体现[11]。东海原甲藻可直接利用无机磷，但其可分泌碱性磷酸酶间接利用葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)、三磷酸腺苷(ATP)和核糖核酸(RNA)等有机磷(Organic phosphorus，OP)化合物维持生长，与无机磷相比发现有机磷对东海原甲藻的增殖作用稍好，对碱性磷酸酶的测定也反映出东海原甲藻对有机磷的利用方式不同[12-14]。林森杰等发现缺磷条件下细胞周期G1期受阻，但在缺磷培养基中加入有机磷ATP后，ATP等可以完全补充东海原甲藻的无机磷源并迅速恢复细胞分裂，东海原甲藻的转录组和mRNA表达与有机磷利用相关的基因表达量显著上调，说明东海原甲藻具有利用核酸、ATP、脂类等多种有机磷[15-16]包括葡萄糖-6-磷酸、磷肌酸、2-磷酸甘油酸、核苷酸、三磷酸腺苷等种类[13]的能力。

前人的研究主要集中在无机磷和有限种类的有机磷对东海原甲藻增殖的影响[13]。鉴于此，本文研究PM4A多磷源对东海原甲藻增殖的影响，选取了59种磷(54种有机磷、5种无机磷)作为磷源，探究东海原甲藻对有机磷的利用特性，结果对于研究东海原甲藻赤潮的发生规律和应对措施具有现实意义。

1 材料与方法

1.1 藻种的培养和有机磷

以东海原甲藻为研究对象，藻株来自于厦门大学海洋藻类资源研究中心(株CCMAXU-364)。所有藻类培养实验均在光照培养箱中进行，光照采用白色冷光源，光照强度2 500 lx，光暗比12 h∶12 h，温度设置为(20±1)℃，培养期间每天定时微振细胞培养板，防止藻细胞黏附及缺氧。实验用f/2培养基进行培养实验。购自于美国Biolog公司的PM4A磷源板，提供了54种有机磷(DOP)和5种无机磷(DIP)。

1.2 实验设计

实验藻种先饥饿处理72 h以耗尽藻细胞内磷酸盐。在紫外线灭菌后的超净台下，向PM4A plate微孔中加入100 μL灭菌海水，充分溶解微孔中磷营养物质作为实验用磷源母液，将各微孔中的磷源母液转移50 μL到细胞培养板对应微孔中。细胞培养板各微孔中分别加入150 μL磷饥饿处理后的东海原甲藻藻液，进行藻类培养实验，实验体积为200 μL，设置2组平行实验。细胞培养板同时放置于同一个光照培养箱进行培养，培养周期为10 d。同时为防止孔板中的培养液蒸发和边缘效应，2组培养板分别套上透明的塑封袋，并在空微孔中加入灭菌海水。接种后暂养1 d，次日起为第1天，之后每天定期放入酶标仪(Perlong DNM-9602)中检测各微孔的吸光度。

1.3 测定和计算方法

1.3.1 细胞计数

在徕卡显微镜(Leica BM-E)下用0.1 mL(20 mm×20 mm)浮游生物计数框计数，根据公式(1)[17]计算细胞初始密度，考虑到实验藻种增殖期间单个细胞的体积差较大，本实验以生物量评价藻种在不同磷源中的生长情况。实验东海原甲藻初始密度为1.04×107cells/L，于徕卡显微镜下拍照计算东海原甲藻的直径大小并取其平均值，将东海原甲藻视为球体计算出体积，藻类的比重接近1，因此，可由藻类体积直接换算生物量(湿重)，藻类生物量为细胞密度乘以藻体平均体积，单位为mg/L或g/m3[17]，实验藻种东海原甲藻的平均体积为0.08×10-4mg/L，由此初始生物量为83.20 mg/L。

(1)

式中，N为细胞丰度(cells/L)；S为计数框面积(mm2)；S0为计数视野面积(mm2)；V0为浓缩后体积(mL)；V为计数体积(mL)；n为计数所得藻类个数(cells)。

1.3.2 酶标仪分析

为了方便测量细胞数量，每天同一时间用酶标仪测定各孔板的OD值，检测波长450 nm处的吸光度[18]。本研究先测定波长为450 nm下不同细胞密度(cells/L)对应不同生物量(mg/L)的藻体与OD值之间的线性关系，发现东海原甲藻生物量在OD450 nm线性关系较好。

藻体生物量(mg/L)=(OD450-0.136 1)/0.000 2(R2=0.927 2)

(2)

1.3.3 生长动力学参数

比生长速率(μ)的计算公式(3)[19]：

μ=(lnXt-lnX0)/t

(3)

式中，X0表示初始细胞生物量(mg/L)；Xt表示t天后细胞生物量(mg/L)；t表示天数(d)。

2 结果与讨论

通过单培养东海原甲藻结果发现其对不同磷源的利用具有选择性，图1为不同时期单培养东海原甲藻时磷源生态位分布。根据每天计算的各微孔中的生物量水平和变化情况发现，培养第8天总体生物量水平达到最高，培养第9天生物量水平存在下降趋势，培养实验第10天结束。东海原甲藻对不同磷源利用的比生长率如图2所示。

2.1 东海原甲藻对有机磷的利用差异

东海原甲藻对各磷源的利用效果和方式存在差异。由实验结果得出有47种磷(5种DIP、42种DOP)可以被东海原甲藻利用。本研究发现东海原甲藻对磷酸乙醇酸(Phospho-glycolic acid)利用效果最好，次之D-甘露糖-1-磷酸(D-mannose-1-phosphate)和磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenol pyruvate)，三者可以促进东海原甲藻的增殖，第8天生物量分别高达1 107.00、802.00和619.50 mg/L，培养周期结束时第10天的比生长速率分别为0.249、0.214和0.209 d-1，东海原甲藻对部分核苷酸(3′-单磷酸胞苷，3′-AMP)、葡萄糖-6-磷酸(D-glucose-6-phosphate，G-6-P)、D-2-磷酸甘油酸(D-2-phospho-glyceric acid)的利用效果较好，3′-AMP能促进东海原甲藻的增殖，其比生长率为0.13 d-1；G-6-P比生长率为0.16 d-1；D-2-磷酸甘油酸比生长率为0.13 d-1。本研究结果与众多学者在东海原甲藻对有机态磷的利用效果的研究方面的结果相似，说明东海原甲藻在天然海水中可利用的磷源种类较多，在无机磷限制的海域可能具有较强的增殖能力。

从事光呼吸作用研究的学者发现了磷酸乙醇酸为该反应过程提供原料。光呼吸作用曾被认为是无用的耗能过程，但近年来的研究结果表明光呼吸过程具有重要的意义，如缓解磷不足对于光合作用的限制，从而减轻光抑制[20]。这为解释东海原甲藻对磷酸乙醇酸的利用效果最佳提供了一个可能原因。

关于藻类吸收利用有机磷的机理，许多学者都提出了自己的理论。洪华生等认为：一是对于小分子有机磷，其利用机制与无机磷相似，可以直接利用；二是对于大分子有机磷，可能需要通过藻类分泌如碱性磷酸酶等物质的作用，被间接利用[21]。林森杰等探究米氏凯伦藻对G-6-P的生物利用度及分子机制，发现G-6-P可以被直接利用，认为可能是因为其作为多种代谢途径的底物，直接摄取能节省水解有机磷和磷酸化的能量[22]。而相比于直接利用，相关诱导酶的合成和分泌可能需要一段时间，这可能会造成藻体生物量水平变化的差异[13]。因此，在本实验结果中，各种磷的利用效果的差异可能与藻类对不同磷源的利用机理和体内酶的种类有关，具体机理还有待进一步研究。

2.2 东海原甲藻对某些有机磷和无机磷的利用效果比较

由本研究实验结果(图1和图2)所知，东海原甲藻对某些有机磷的利用效果与对无机磷的利用效果相当甚至更高。东海原甲藻利用的5种无机态磷：磷酸盐、焦磷酸盐、三偏磷酸钠、三聚磷酸盐、次磷酸钠，其最高生物量(第8天)分别达到502.00、467.00、279.50、314.50、159.50 mg/L，培养周期结束时(第10天)生物量分别为362.00、379.50、147.00、182.00、89.50 mg/L，比生长速率分别为0.14、0.15、0.06、0.08、0.01 d-1。东海原甲藻对硫代磷酸盐(酯)、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸乙醇酸、D-甘露糖-1-磷酸、D-甘露糖-6-磷酸、六磷酸肌醇(植酸)在生物量最高和培养周期结束时的生物量水平均高于无机态磷，这6种有机磷和二硫代磷酸盐、D-G6P等磷源培养的东海原甲藻比生长率也高于上述5种无机态磷。赵艳芳等利用NaH2PO4、G-P、ATP 和G-6-P等4种磷源对东海原甲藻进行培养，发现有机磷源对东海原甲藻的增殖作用效果比无机磷酸盐稍好[13]，与本次实验结果相似，这表明有机磷化合物在东海原甲藻赤潮的形成过程中可能发挥着不可忽视的作用。

2.3 东海原甲藻可利用的有机态磷的酯键比较

3 结论

1)东海原甲藻可以利用PM4A 板上59种磷源中的47种磷，其中无机磷5种、有机磷42种，但是利用效果各不相同，对磷酸乙醇酸、D-甘露糖-1-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸的利用效果较好。

2)东海原甲藻对PM4A 板上的含有C-O-P酯键的有机磷利用效果更好，某些有机磷对于东海原甲藻的营养价值高于无机磷，这表明有机磷可能成为影响东海原甲藻类生长的重要磷源。