贝伐珠单抗改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维化

黄超文 赵强 钟莲娣 先俊 钟雪莺 仝金斋 黄炎明

江门市中心医院呼吸内科一区（广东江门 529000）

肺纤维化是间质性肺病中最常见的一种类型，具有高病死率和日益增长的发病率，但目前仍缺乏有效的治疗手段。肺纤维化的病理特征为肺泡上皮损伤、异常的血管修复和重塑、炎症浸润、肺成纤维细胞细胞增殖活化及肺间质胶原沉积，但其发病机制尚不清楚。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）目前被认为是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子。近年来，研究发现VEGF不仅参与全身的血管生成，还与多种肺部疾病相关，其与肺纤维化的联系也日渐受到关注。研究显示转入抗VEGF的sflt-1基因可抑制博来霉素（Bleomycin，Blm）诱导的小鼠肺纤维化[1]，提示VEGF在纤维化进程中具有重要作用。同时活性维生素D 1，25（OH）2D3（VD）在慢性气道疾病中的作用亦被逐渐证实，VD具有可抑制VEGF对气道屏障的破坏[2]、气道平滑肌细胞增殖[3]、促肿瘤细胞迁移[4]和改善肺纤维化[5]等作用。由于目前多种VEGF的抑制剂已上市，而贝伐珠单抗（Bevacizumab，Bev）始终是现有的确切有效且安全的VEGF抑制性药物[6-8]。结合本课题组已发现VD可减轻肺纤维化[5]，Bev可减轻哮喘小鼠的气道炎症[9]，因此，本研究在前期肺纤维化研究基础上，采用VD作为对照，在博来霉素诱导肺纤维化小鼠模型中首次探讨Bev对肺纤维化的影响，评价其是否可特异性抑制VEGF，为肺纤维化的治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 动物与材料SPF级C57B/L小鼠共40只（购自广东省医学动物实验中心），6～8周龄，体重20～24 g，饲养于南方医科大学动物实验中心。VEGF-A、TNF-α、IL-4 Elisa试剂盒购自 eBioscience；HE染色试剂盒、羟脯氨酸含量测定试剂盒、DAB显色试剂盒，α-SMA抗体（abcam）。

1.2 分组处理将小鼠随机分为4组：对照组（Con组）、博来霉素诱导肺纤维化组（Blm组）、博来霉素诱导肺纤维化后1，25（OH）2D3治疗组（Blm+VD组）、博来霉素诱导肺纤维化后贝伐珠单抗治疗组（Blm+Bev组）。具体方法：腹腔注射1%戊巴比妥麻醉小鼠，Blm组气管内单次注射3U/Kg Blm以制备肺纤维化小鼠模型；Con组经气管内单次注射等体积生理盐水；Blm+VD及Blm+Bev组：造模过程同Blm组，造模成功后每日经腹腔注射5 μg/kg VD或经鼻滴入5 mg/kg贝伐珠单抗；VD或贝伐珠单抗治疗第21天，摘取眼球放血处死小鼠并收集、保存肺组织及肺泡灌洗液。

1.3 肺纤维化程度评定肺组织H&E染色、肺纤维化评分（Ashcroft评分）、羟脯氨酸含量测定、α-SMA免疫组化。

1.4 细胞因子检测收集肺支气管肺泡灌洗液（BALF），经离心后取上清，Elisa法检测VEGF-A、IL-4、TNF-α。

1.5 统计学分析使用SPSS 19.0进行统计和分析，计量资料以均数±标准差表示，方差齐时采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间多重比较应用Bonferroni法；不满足方差齐性时使用Welch法比较，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BALF中VEGF-A的表达Blm组小鼠的BALF中VEGF-A含量明显升高，与Con组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。Blm+VD组和Blm+Bev处理的纤维化小鼠的VEGF-A表达均有所减少，其中以Blm+Bev组下降更为明显，与Blm组对比差异均有统计学意义（均P＜0.05）（图1）。

2.2 各组小鼠肺组织病理结果如图2-A所示，Con组小鼠的肺泡结构完整，肺组织未见炎症细胞浸润或胶原纤维沉积。博来霉素可成功制备肺纤

图1 各组小鼠BALF VEGF-A表达情况Fig.1 The expression of VEGF-A in BALF of mice

维化小鼠动物模型，表现为Blm组小鼠肺组织难以看见正常肺泡结构，肺泡间质中胶原纤维大量沉积，成纤维细胞增生聚集、大量炎症细胞浸润（淋巴细胞、巨噬细胞），Ashcroft纤维化评分平均约为5分（图2-B）。Blm+Bev组和Blm+VD组仍可见部分正常排列而完整的肺泡，其肺间质中炎症细胞明显减少，胶原纤维增生较轻，对比Blm组，两组纤维化评分降低（P＜0.05）。与Con组相比，Blm组小鼠羟脯氨酸含量明显增加，差异具有统计学意义；Blm+Bev组和Blm+VD组的羟脯氨酸含量均较Blm组有下降，差异具有统计学意义，但Blm+VD组与Blm+Bev组之间比较未见统计学意义（P＞0.05，图2-C）。Blm+Bev组及Blm+VD组肺组织中胶原增生较Blm组有减轻，这与HE染色、Ashcroft评分结果是一致的。

2.3 肺组织α-SMA表达免疫组化显示Blm组小鼠肺组织α-SMA含量明显增加，呈广泛分布的棕黄色，Blm+VD组与Blm+Bev组小鼠的α-SMA阳性细胞明显减少（图3）。

2.4 BALF中炎症因子表达Blm组小鼠可造成BALF中TNF-α、IL-4含量均显著增高，对比Con组小鼠，差异具有统计学意义（P＜0.05）。Blm+Bev组及Blm+VD组的BALF中TNF-α、IL-4含量较Blm组明显下降（均P＜0.05）；Blm+VD组与Blm+Bev组两组间比较均无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

3 讨论

肺纤维化目前治疗手段仍十分有限，目前研究主要针对减轻炎症反应和抑制肺成纤维细胞细胞增殖活化及肺间质胶原沉积，本研究首次证明抑制VEGF可减轻博来霉素所致的肺组织炎症细胞浸润、肺成纤维细胞活化及胶原纤维的增生，从而抑制肺纤维化的形成和发展。

图2 各组小鼠肺纤维化情况Fig.2 The effect of pulmonary fibrosis in mice

图3 各组小鼠α-SMA免疫组化结果Fig.3 Immunohistochemical staining of α-SMA in mice

气管内注射博来霉素是肺纤维化小鼠模型的最经典的造模方式[10]。本研究经气管内注射博来霉素的小鼠的肺组织可见正常肺结构大面积被破坏、肺泡间隔增厚，肺间质严重炎症细胞浸润和细胞外基质如胶原纤维的增生，这表明已成功构建小鼠肺纤维化模型。本研究发现博来霉素诱导的肺纤维化小鼠的BALF中VEGF-A含量升高，这与国外研究结果[7-8]是一致的。VEGF-A是VEGF家族中最受关注的一种亚型，VEGFR-2是其主要受体。Bev可通过与VEGFR-2竞争性结合VEGF-A，从而抑制VEGF-A的作用[9]。既往认为，VEGF-A主要作用为促血管新生和调节血管通透性，然而近2年研究发现VEGF-A参与更多的肺部疾病中，如哮喘[2，9]、气道重塑[3]、急性肺损伤[10]、肺癌[11]等，其在肺纤维化中的作用更是备受争论的热点。本研究发现Bev可明显减少小鼠BALF中VEGF-A的表达，其含量甚至低于正常小鼠，这提示其对VEGF的有效抑制作用。更重要的是，贝伐珠单抗处理后小鼠的肺组织肺泡紊乱破坏、胶原病理性沉积得到有效改善，免疫组化结果显示肺部纤维化标志蛋白α-SMA的表达明显下降、成纤维细胞增殖活化也受到抑制。其作用效果与VD相近，证明贝伐珠单抗具备抗肺纤维化的潜能。值得注意的是，具有抗纤维化作用的VD处理后，小鼠BALF中的VEGF-A含量下调。VD可在多种细胞模型中调节VEGF的表达，例如可抑制气道平滑肌细胞、气道上皮细胞释放VEGF，从而参与哮喘的发生。这进一步提示VEGF-A参与肺纤维化的发生发展，而VD可能部分通过调节VEGF发挥对肺纤维化的保护性作用。

图4 小鼠BALF TNF-α、IL-4表达情况Fig.4 The expression of TNF-α，IL-4 in BALF of mice

肺成纤维细胞细胞过度活化、增殖、迁移一直是肺纤维化机制的研究重点。国外研究证明VEGF可促进成纤维细胞的功能：重组VEGF-A可直接刺激肺成纤维细胞分泌过量的细胞外基质[12]，VEGF的抑制剂可抑制人肺成纤维细胞迁移能力[3]。本研究在体内水平发现博来霉素组小鼠纤维化的肺组织中表达α-SMA阳性的细胞明显增多、聚集成团，其中以纤维细胞表达为主，且单个细胞内α-SMA表达量明显升高，成纤维细胞过度活化。而使用贝伐珠单抗抑制VEGF后，小鼠肺间质中成纤维细胞数目减少、α-SMA的表达也受到抑制，这些结果提示Bev对肺纤维化的具有确定的保护作用。学者发现VEGF也参与多种肺部炎症相关性疾病如哮喘、ARDS等的发生。VEGF可促进哮喘模型中Th2炎症因子的释放[13]，激活经典炎症信号通路-NF-κB信号通路，参与哮喘形成；Bev可抑制屋尘螨诱导气道炎症反应。本研究中Bev干预后小鼠肺部炎症浸润较造模组明显减轻，而BALF中炎症因子IL-4、TNF-α的表达也相应下降。这提示Bev可抑制肺部炎症反应从而改善肺纤维化。但必须指出的是，博来霉素肺纤维化模型早期以炎症反应占主导，后期以纤维化进程为主。因此，若要深入研究VEGF与肺炎症反应在肺纤维化中的作用，须进一步观察造模后第7、14天的小鼠炎症因子变化。此外，由于本研究中仅探讨其在炎症因子及纤维化的病理改变情况，研究不足之处在于尚未探讨成纤维细胞增殖活化与抑制VEGF的关系，因成纤维细胞增殖活化仍是目前治疗纤维化的主要手段之一[14]。下一步拟进行成纤维细胞增殖活化与VEGF/VFGFR信号通路关系的研究。

综上所述，本研究首次提出Bev可改善博来霉素诱导的肺纤维化，其作用机理与抑制VEGF对肺部炎症、肺成纤维细胞活化和细胞外基质增生的作用相关。抑制VEGF可能成为治疗肺纤维化的新思路。