结直肠癌患者 KRAS、NRAS、BRAF基因突变与临床病理特征关系的研究

贠 田，王长松，李富林，吕学霞，蒙念龙，高春芳

散发性结直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，发病率和病死率长期高居恶性肿瘤前列。结直肠癌的发生发展是多基因、多步骤的复杂过程，个体差异较大，随着精准治疗时代的来临，基于基因检测治疗策略的选择在提升结直肠癌的诊治水平中发挥着巨大的作用，在结直肠癌靶向治疗过程中检测KRAS、NRAS、BRAF基因突变状态对于结直肠癌的治疗有很重要的意义［1，2］。结直肠癌是一个复杂的多基因参与的疾病，这些个体化药物的靶点基因在结直肠癌中起到关键的作用，因此探讨这些靶点与病理学因素之间的关系也很有必要。此前也有很多的文献对这些基因进行研究，但是学者们对于这些基因与临床病理之间的关系众说纷纭，因此该文采用大样本量的病例更进一步研究在结直肠癌患者中，KRAS、NRAS、BRAF 基因状态与病理学因素之间的关系，以便能得到一个更确切的结果。

1 资料与方法

1.1 一般资料所有检测样本均来自2013年9月—2017年7月笔者所在医院病理科留存蜡块389例，均为结直肠癌病理诊断明确的肿瘤标本。其中男 225例，女 164例；年龄27～92岁，中位年龄 60岁。所有患者均经病理组织学检查，确诊为结直肠癌患者。所有患者在做KRAS、NRAS、BRAF检测前均知情同意并签署知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂和仪器 石蜡组织样本DNA分离试剂盒购自福建厦门艾德有限公司，KRAS、NRAS、BRAF基因突变检测试剂盒购自厦门艾德公司。核酸蛋白质浓度测量仪B-500购自上海创萌生物科技有限公司，Mx3000P实时荧光定量PCR仪购自美国Stratagene公司。

1.2.2 DNA提取 比照苏木精-伊红染色在显微镜下标记肿瘤区域，切片过程中仅选取相关肿瘤区域，将含有肿瘤区域的DNA组织的蜡块10μm厚连续切片5张，严格按照试剂盒说明步骤进行操作。DNA提取后应用核酸蛋白质浓度测量仪测量DNA质量及浓度。按照测量的DNA浓度稀释至2～5 mg/L备用。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测 KRAS基因突变检测试剂盒检测KRAS基因的12、13、61密码子上的7种突变类型。NRAS检测外显子2的12、13密码子，外显子3的59、61密码子，外显子4的117、146密码子。BRAF基因突变检测15外显子上的V600E突变。检测仪器使用的是美国的Agilent Mx3000P。检测程序按照试剂盒说明书设定。

1.3 统计学分析所有数据采用SPSS 19.0统计软件，结果运用χ2检验及Fisher确切概率法，检验水准α=0.05，并设定P值为双侧分布，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KRAS基因突变与临床病理参数之间的相关性检测结直肠癌中KRAS基因第12、13位密码子7种热点突变，总突变率为42.4%（165/389）。389例结直肠癌中，KRAS基因在直肠的突变率 （50%，120/240） 显著高于结肠 （30.2，45/149，P＜0.05）。KRAS基因突变与性别，年龄、肿瘤分化程度，TNM分期，有无淋巴结转移以及远处转移特征无明显相关（P＞0.05）。 见表 1。

2.2 NRAS基因突变与临床病理参数之间的相关性检测结直肠癌中 NRAS基因第 12、13、59、61、117和146密码子突变，总突变率为4.6%（18/389）。389例结直肠癌中，NRAS基因突变率与患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤分化程度、TNM分期，有无淋巴结转移以及有无远处转移其他临床病理特征无明显相关（P＞0.05，表1）。 NRAS基因突变的结直肠癌中未同时检测到KRAS基因突变。

表1 389例结直肠癌患者KRAS、NRAS和BRAF基因突变分析

表2 389例结直肠癌患者KRAS、NRAS和BRAF基因突变分析

2.3 BRAF基因突变与临床病理参数之间的相关性检测结直肠癌中BRAF基因第600位密码子突变 GTG→GAG （V600E），突变率为 4.1%（16/389）。389例结直肠癌患者中，BRAF基因突变与患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤分化程度、TNM分期、有无淋巴结转移以及有无远处转移无相关性 （P＞0.05，表1）。BRAF基因V600E突变的结直肠癌中未同时检测到KRAS基因突变。

2.4 KRAS、NRAS和BRAF基因突变分析在389例结直肠癌患者中，KRAS基因突变率为42.4%（165/389），12、13密码子中检测的 7个常见突变的比 率 分 别 为 GGT→GAT （14.7% ），GGT→GTT（7.96%），GGC→GAC （7.46%），GGT→GCT（6.94），GGT→TGT （2.31%），GGT→AGT （2.06%），GGT→CGT（0.77%）。其中以 GGT→GAT突变率最高14.7%，最为常见，GGT→GTT（7.96%）次之。 NRAS总突变率为 4.6%（18/389）， 在 12、13、61、117 和146密码子中检测17种常见的突变，其中共有4种常见的突变，位于12、13和61密码子上，分别为：GGT→GAT（12 号密码子 0.8%）、GGT→GAT（13 号密码子 0.5%）、GAA→CTA （1.8%）、GAA→AAA（1.5%）。BRAF 基因 V600E点突变率 4.1%（16/389）。 见表 2。

3 讨论

结直肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率呈明显上升趋势，逐渐成为一种严重危害人类健康的恶性疾病。随着靶向治疗的应用，结肠癌患者预后有了明显改善［2，3］。 KRAS、NRAS 以及BRAF是Ras-Raf-MEK-ERK通路中的重要组成部分，而该通路对于细胞增殖、分化、基因表达、有丝分裂以及细胞凋亡有重要的调控作用。

结直肠癌KRAS基因突变率为30%～60%，结直肠癌中KRAS基因突变主要集中12、13密码子上［4］。 该实验 KRAS基因总突变率为 42.4%（165/389），在389例结直肠癌中，KRAS基因在直肠的突变率（50%，120/240）显著高于结肠（30.2，45/149，P＜0.05），表现在直肠中KRAS基因更易发生突变。目前的研究热点对于右半结肠与左半结肠由于胚胎来源的差异，其分子特征、致癌基质等方面也存在相应的差异已经得到各界的认可。对于结肠和直肠由于部位、功能的差异是否也存在着基因的差异有待进一步的研究。

NRAS是RAS基因家族中的一员。NRAS基因在结直肠癌中突变率为1%～6%，NRAS突变主要位于外显子2、3、4的多个密码子上，这些密码子编码的氨基酸是RAS蛋白和GTP酶活化蛋白（GAP）的作用位点，突变可导致RAS-GTP处于持续激活状态，引起细胞恶性增殖和转移［5］。NRAS在结直肠癌中突变率报道并不多见，有国外的研究发现，NRAS的突变率不高，在西方人中大约为3.8%，亚洲人的突变率为 3.6%，阿拉伯人中的突变率为 4%［6，7］。 该研究发现NRAS的突变率为4.6%，与国内外的大多数研究结果相同。在NRAS的突变与临床病理特征之间的关系方面，国外的研究并没有发现NRAS突变与之有关的病理特征。该研究389例结直肠癌患者中，NRAS总突变率为4.6%（18/389），总体突变率不高。同时没有发现NRAS的突变结直肠癌患者年龄，性别，肿瘤分化程度，TNM分期，有无淋巴结转移以及远处转移特征明显相关性（P＞0.05）。

BRAF基因位于7q34，长约190kb，在绝大多数组织和细胞类型中，BRAF是MEK/ERK最为关键的激活因子。BRAF蛋白的主要功能为有丝蛋白激酶（MAPK）通路中的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，该激酶将帮助信号从RAS转导至MEK1/2，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等［8］。对于BRAF基因在结直肠癌中突变率研究国内外也存在着很多不一致，在西方人群中BRAF的突变率为9.2%，亚洲人群的突变率为4.9%，中东人群的突变率为4.6%［9］。国内的研究认为，BRAF的突变率为3%～8%［10］，在BRAF基因突变主要与肿瘤直径、患者年龄以及有无转移有相关性。而在该研究中发现，BRAF基因与患者年龄有相关性 （P＜0.05），与患者性别，肿瘤分化程度，TNM分期，有无淋巴结转移以及远处转移特征无明显相关 （P＞0.05）。与临床病理关系存在突变率差异的原因有多方面的，样本量的多少会直接影响统计的结果，检查方法的不同，也会造成结果的差异性。

综上所述，对KRAS、NRAS及BRAF基因进行分析，KRAS的突变率明显高于NRAS与BRAF，可见在结直肠癌中KRAS突变时常见的生物学事件，而在KRAS突变的患者中并没有发现NRAS以及BRAF突变，可见三者的发生是属于相互联系的通路，一个基因发生突变将制约另外两个基因的发生改变。KRAS、NRAS和BRAF基因检测人群的筛选对结直肠癌患者治疗方案的选择意义重大，能够更有效地指导精准医学个体化治疗。