谷氨酰胺缺乏对宫颈癌Hela细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其机制

2019-08-24马瑞肖张慧杰李馨慧张淑兰

中国医科大学学报 2019年8期

马瑞肖，张慧杰，李馨慧，张淑兰

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110004）

宫颈癌具有高发病率、高死亡率的特点，且近年来发病率呈现年轻化趋势［1-2］。虽然肿瘤的发病机制错综复杂，但是大部分肿瘤都可以通过改变细胞内代谢方式来满足其物质和能量的需求。除肿瘤细胞内有氧糖代谢引起关注外［3］，谷氨酰胺（glutamine，Gln）提供碳源推动三羧酸循环提供能量，提供氮源合成其他氨基酸、核苷酸等大分子物质，以及合成还原性物质维持细胞内的氧化还原平衡，支持了肿瘤细胞的生长［4-6］。因此，本研究主要探讨Gln缺乏对宫颈癌Hela细胞增殖、迁移、凋亡的影响及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株：宫颈癌细胞Hela细胞株，购自中国科学院细胞生物研究所细胞库。

1.1.2 试剂和仪器： DMEM， high glucose， pyruvate，no glutamine培养基（Thermo Fisher Scientific，10313039）；L-glutamine （200 mmol/L）（Thermo Fisher scientific）；双抗（美国Hyclon公司）；CCK-8 试剂盒；胎牛血清（Aus Genenx，货号：FBS500-S）；细胞培养箱（美国Termo公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：将Hela细胞冻存管从-80 ℃冰箱中取出，迅速放入37 ℃水浴锅中快速摇晃，待融化后将细胞悬液移至15 mL离心管中，加入正常完全培养基，即10%FBS+4 mmol/L Gln+1%双抗（青霉素+链霉素）的DMEM高糖培养基4 mL，混匀，转速1 000 r/min，离心5 min，弃掉上清液，加入完全培养基吹打为单细胞悬液后移至T25培养瓶中放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养，此为细胞复苏过程；细胞换液：弃去旧培养基，PBS冲洗，再加入适量新鲜的完全培养基继续培养；细胞传代：用0.25%胰蛋白酶消化、收集细胞后加入新鲜的完全培养基，按1∶2～1∶4传代培养；细胞冻存：用细胞冻存液（完全培养基∶DMSO=9∶1）冻存细胞。因正常培养基中Gln浓度为4 mmol/L，后续实验均以含4 mmol/L Gln培养基为对照组。

1.2.2 CCK-8方法检测各组细胞增殖情况：胰酶常规消化对数生长期的Hela细胞，配制单细胞悬液，计数细胞，调整细胞密度为5×104/mL，种于96孔板，每组设置3个副孔，培养箱培养24 h；显微镜下观察细胞贴壁后，弃去旧培养基，加入含不同浓度Gln完全培养基（其中0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L Gln为实验组、4 mmol/L Gln 为对照组）继续培养48 h后更换新培养基100 μL/孔+10 μL CCK-8溶液/孔，放入培养箱中继续培养1～2 h；用酶标仪测定在450 nm的吸光度；然后于原相应Gln浓度的培养基中继续培养48 h后，用上述同样的方法测定每孔的吸光度（optical delnsity，OD）。计算细胞生长抑制率，抑制率=1-增殖率，增殖率= （实验组OD值-调零孔OD值） / （对照组OD值-调零孔OD值）］。该实验重复5次。

1.2.3 细胞划痕实验观察不同Gln浓度条件下Hela细胞迁移能力：取对数生长期的细胞，胰酶常规消化后，2 mL/孔平均铺于6孔板，放入培养箱中培养过夜；次日显微镜下观察细胞生长约90%，用直尺和10 μL枪头垂直划痕；用PBS冲洗3遍，分别加入含不同浓度Gln+3%FBS的培养基（其中0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L Gln为实验组、4 mmol/L Gln为对照组）于37 ℃，5%CO2的培养箱内继续培养；于0点和12点在显微镜下拍照。该实验重复3次。

1.2.4 PE Annexin V Apoptosis Detection Kit 方法检测各组Hela细胞凋亡的情况：取对数生长期的Hela细胞，胰酶常规消化后，500 μL/孔平均铺于24孔板，放入培养箱中培养，次日弃去旧培养基，加入含不同浓度Gln完全培养基（其中0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L Gln为实验组、4 mmol/L Gln为对照组）继续培养48 h后按照试剂盒说明书进行。该实验重复3次。

1.2.5 DCFH-DA活性氧荧光探针检测各组Hela细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平：常规消化收集细胞，2 mL/孔平铺于6孔板后，放入培养箱中培养，次日弃去旧培养基，加入含不同浓度Gln完全培养基（其中Gln为0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L为实验组、4 mmol/L Gln为对照组）继续培养48 h后按照试剂盒说明书进行。该实验重复3次。

1.3 统计学分析

采用Graph Pad Prism 7软件作图分析。采用SPSS 16.0 统计软件进行统计学分析，数据以表示；多组比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检测法，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Gln缺乏抑制Hela细胞增殖

相对于在含4 mmol/L Gln培养基中培养48 h的Hela细胞，当Gln＜2 mmol/L时，Hela细胞生长明显受到抑制（P ＜ 0.05），且随着Gln浓度降低，Hela细胞生长抑制率升高；在Gln≤1 mmol/L时，相同Gln浓度条件下培养96 h的Hela细胞生长抑制率普遍比培养48 h高（表1）。说明Hela细胞生长与Gln呈剂量依赖性和时间依赖性。

2.2 Gln缺乏抑制Hela细胞迁移

相对于在含4 mmol/L Gln培养基中培养的Hela细胞，当Gln＜2 mmol/L时Hela细胞的划痕愈合率显著下降，且随着Gln浓度的降低，划痕愈合率越低，细胞的迁移能力也越小（表2，图1）。说明了Gln维持着Hela细胞的迁移能力。

表1 不同浓度Gln处理的Hela细胞在不同时间点的细胞生长抑制率（n = 5，）Tab.1 Cell growth inhibition rate at different time points of cells treated with different concentrations of Gln （n = 5，）

Compared with 4 mmol/L Gln group，1） P ＜ 0.01，2） P ＜ 0.05.

Group 48 h 96 h 4 mmol/L Gln 0.002±0.004 0.000±0.000 2 mmol/L Gln 0.064±0.105 0.058±0.0262）1 mmol/L Gln 0.166±0.0781） 0.262±0.2292）0.5 mmol/L Gln 0.278±0.1061） 0.380±0.1211）0.1 mmol/L Gln 0.442±0.1141） 0.656±0.1331）0 mmol/L Gln 0.628±0.1611） 0.714±0.1331）

2.3 Gln缺乏诱导Hela细胞凋亡

相对于在含4 mmol/L Gln培养基中培养的Hela细胞，当Gln＜0.5 mmol/L时Hela细胞的死亡数显著增多（P ＜ 0.05），Gln≥1 mmol/L时不能诱导Hela细胞凋亡（表2，图2）。说明Gln浓度降低到一定程度时可诱导Hela细胞凋亡。

2.4 Gln缺乏诱导Hela细胞内ROS水平升高

相对于在含4 mmol/L Gln培养基中培养的Hela细胞，当Gln＜1 mmol/L时Hela细胞内平均荧光强度显著增强（P ＜ 0.05），且随着Gln浓度降低，Hela细胞内ROS水平升高，Gln≥1 mmol/L时不能影响细胞内ROS水平变化，见表2。表明了Gln缺乏可诱导Hela细胞内ROS水平升高。

表2 不同浓度Gln处理组Hela细胞迁移能力、凋亡百分比和细胞内ROS水平情况（n = 3，）Tab.2 Migration ability，apoptosis percentage，and intracellular ROS level of Hela cells treated with different concentration of Gln （n =3，）

Compared with 4 mmol/L Gln group，1） P ＜ 0.01，2） P ＜ 0.05.

Group Wound healing rate Percentage of apoptosis （%） Mean fluorescence intensity 0 mmol/L Gln 0.209±0.0481） 10.717±1.9691） 309.300±104.6002）0.1 mmol/L Gln 0.277±0.0321） 9.930±1.4131） 216.700±65.9002）0.5 mmol/L Gln 0.326±0.0201） 6.237±1.910 209.000±43.5002）1 mmol/L Gln 0.403±0.0362） 3.883±0.670 179.700±42.500 2 mmol/L Gln 0.459±0.017 3.143±0.263 156.700±99.900 4 mmol/L Gln 0.503±0.020 3.023±1.155 92.600±33.900

图1 在不同浓度Gln中Hela细胞在0 h和12 h的迁移位置

图2 Gln缺乏对Hela细胞凋亡的影响

3 讨论

宫颈癌严重危害着女性健康，从1956年“Warburg效应”发现到2011年报道肿瘤细胞代谢改变为肿瘤特征之一，肿瘤代谢重编程成为了肿瘤研究的新热点［1-3，6］，这为寻找新的更有效的宫颈癌治疗方法提供了方向。

因存在“Warburg效应”，葡萄糖来源的丙酮酸仅少部分进入TCA循环，绝大多数通过乳酸脱氢酶以乳酸形式排出。在这种情况下，Gln可以很好地回补TCA循环为肿瘤细胞提供能量，合成NADPH和GSH，维持细胞内氧化还原平衡状态等［4，6］。众所周知，急性高浓度ROS导致细胞衰老甚至死亡［7］，因此Gln代谢对肿瘤细胞的生长非常重要。

WANG等［8］研究表明，Gln蛋白转运体ASCT2在前列腺癌组织中高表达，抑制前列腺癌细胞中ASCT2的功能导致Gln摄取减少可能是抑制细胞增殖和细胞周期的主要原因。LAMPA等［9］研究表明，抑制谷氨酰胺酶使Gln代谢途径流量减少，从而抑制三阴性乳腺癌细胞生长。本研究发现Gln缺乏显著抑制宫颈癌Hela细胞生长，且呈时间依赖性和剂量依赖性，与上述研究结果相符合。赖彦等［10］研究发现肺腺癌A549细胞在4 mmol/L Gln的培养基中抑制率为0，在0 mmol/L和2 mmol/L Gln培养基中Gln浓度越低，作用时间越长，细胞抑制率越高且差异有统计学意义，与本研究结果一致。过表达miR-513c可抑制神经母细胞中谷氨酰胺酶的表达从而抑制了细胞增殖、迁移和侵袭［11］。康德［12］研究表明谷氨酰胺酶GAC变构抑制剂-968抑制非小细胞肺癌细胞迁移。本研究发现随着Gln浓度越低，Hela细胞迁移能力越低。Gln＜0.5 mmol/L时细胞迁移能力明显下降且有统计学差异，与上述研究结果相符合。Gln缺乏诱导肿瘤细胞凋亡可能与ATP、嘧啶环合成减少、细胞周期阻滞等有关，也有研究［13-18］报道Gln饥饿或敲低谷氨酰胺酶引起细胞内ROS水平显著升高导致细胞死亡。李哲等［13］研究发现EGCG可通过降低谷氨酰胺脱氢酶活力来抑制结直肠癌DLD-1细胞增殖并诱导其凋亡。KOYUNCU 等［16］研究结果表明芳香磺胺S-1通过上调ROS的产生来诱导CAIX表达阳性的宫颈癌Hela细胞凋亡。本研究发现Gln＜0.5 mmol/L时Hela细胞凋亡数显著增多，Gln≤0.5 mmol/L时Hela细胞内ROS水平也显著升高，与上述研究相符合，提示Gln缺乏可通过诱导Hela细胞内ROS水平升高导致其凋亡。但是当Gln≥8 mmol/L时，Gln浓度越高、作用时间越长，抑制率越高，提示Gln抑制A549细胞生长，在含32 mmol/L Gln培养基中A549细胞迁移数明显少于在含4 mmol/L Gln培养基中［10］。结果的差异在于所取Gln浓度不一样。目前很多研究［19-22］表明，给予恶性肿瘤患者Gln支持治疗有助于提高免疫功能、减缓恶液质形成等，并且还没有证据证明其有促进肿瘤的作用，因此Gln营养过剩时对宫颈癌细胞生物学行为的影响及机制的进一步研究，能为宫颈癌治疗提供理论依据，对提高宫颈癌的治疗效果和改善宫颈癌患者生活质量有重要意义。

总之，本研究结果显示，Gln缺乏能抑制宫颈癌Hela细胞增殖、迁移，诱导其凋亡，作用机制可能与诱导细胞内ROS水平升高有关。