白细胞介素-1β和电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

韦盛 杨勇 赵东明 刘朝旭 吴华

骨折后骨骼修复愈合是一个很复杂的过程，包括早期的炎症反应期、修复期和骨痂形成期。早期的炎症反应从血管损伤出血形成血肿开始，局部聚集大量炎症细胞和成纤维细胞。血肿中富含可向多系分化的间充质前体细胞。巨噬细胞产生大量细胞因子和生长因子，促进细胞汇聚到损伤部位而促进细胞的分化、胶原合成和血管生成，其中包括肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF-α），白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）及其他炎症因子。由巨噬细胞生成的IL-1β可促进IL-6、前列腺素和其他继发性的促炎症信号因子的释放，同时促进新鲜的血管生成和软骨形成。IL-1β可以通过多种信号通路途径参与多种细胞的损伤、炎症反应、免疫调节等活动，是炎症反应中极为重要的一个因素［1］。

同时电磁场刺激既可以促进骨折愈合，也能加速软组织损伤的恢复，具体的作用效果跟电磁场的波形、场强、频率、刺激持续时间及其他外界干预条件，如：培养基类型等，都有密切关系［2］。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）具有多系分化的能力，在特定的电磁场刺激和外界干预作用下BMSCs可以向成骨、成软骨或成脂肪分化［3］。

电磁场刺激能阻碍IL-1β对间充质干细胞软骨生成的抑制作用［4］，但对于间充质干细胞在电磁场和IL-1β影响下的成骨分化作用仍需进一步研究。IL-1β能单独激活对成骨分化有重要作用的p38、ERK1/2和JNK1/2信号通路，它也可以和TNF-α一起激活p38和ERK1/2而降低BMP-2诱发的Runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2,Runx2）表达［5］。

本研究旨在探讨IL-1β和电磁场对大鼠BMSCs的成骨分化的作用，为电磁场在促进骨折恢复的临床应用提供更多理论依据。

材料与方法

一、主要试剂和仪器

DMEM-F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、成骨诱导培养基（Gibco，美国）；Trizol试剂盒、逆转录试剂盒（Invitrogen，美国）；IL-1β（Peprotech，美国）；RIPA裂解液（博士德，中国）；Runx2、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、GAPDH和p38磷酸化抗体（Abcam，英国）；电磁场仪器由中国海军工程大学制造提供。本实验使用的电磁场类型为正弦交变电磁场，磁场参数：磁感应强度1 mT，频率50 Hz，每天刺激时间为4 h；5%二氧化碳培养箱（Thermo Forma，美国）；台式水平离心机（Heal Force，中国）；实时定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）仪，Gel DocTMXR+凝胶成像系统（BIO-RAD，美国）；酶标仪（Bio Tek，美国）。

二、大鼠间充质干细胞的获取及培养

取100 g左右的雄性大鼠（由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供）断颈法处死后获得其股骨和胫骨，用注射器吸取培养基冲洗出骨髓后吹打成细胞悬液种植到25 cm2无菌培养瓶，细胞长至90%左右铺满瓶底时用0.25%胰酶消化细胞并按1∶2比例传代。第三代细胞按约1×105个/ml的密度种植到6孔板，随机分为4组：对照组、IL-1β组、电磁场组和IL-1β+电磁场组。IL-1β组及IL-1β+电磁场组每次换新鲜培养基时每孔加入1 ng/ml的IL-1β，电磁场组和IL-1β+电磁场组每天用电磁场刺激4 h。隔天更换新鲜成骨诱导培养基。另外取3块未分组的6孔板培养细胞隔天换液待细胞长至90%左右铺满瓶底时提取蛋白质。

三、荧光定量PCR检测基因的表达

用成骨诱导培养基培养3 d后，每孔加入1 ml Trizol提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明书操作，将mRNA逆转录成cDNA，应用SYBR Green荧光染料技术行荧光定量PCR，检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、OPN、Runx2的基因表达。相关指标的引物设计见表1。反应条件：95℃变性5 s，55℃退火15 s，72℃延伸10 s，一共40个循环。用同样方法分析经过7 d培养刺激后ALP、OPN、Runx2的mRNA基因表达。用2-△△CT法进行相对定量计算。

四、Western blotting分析

用成骨诱导培养基培养3 d后，收获利用RIPA提取的总蛋白，于垂直电泳槽中进行SDS-PAGE电泳。转膜后加OPN一抗、二抗孵育，底物化学发光ECL显色后，Gel DocTMXR+成像系统曝光后进行分析同样方法检测Runx2蛋白的表达情况。另取两组细胞，分别加入1 ng/ml的IL-1β，1 ng/ml的IL-1β+抑制剂SB203580后，给予15 Hz/1 mT的低频正弦波电磁场刺激并分别于0、5、15、30、60及120 min提取蛋白质，同样方法检测p38的蛋白质表达情况。

五、统计方法

每组实验均重复3次，用SPSS 18.0统计学软件（IBM公司，美国）分析数据，结果用平均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 RT-PCR引物序列

结 果

一、第3天实时定量PCR检测

实时定量PCR检测各组ALP、OPN、Runx2的表达，以GAPDH为内参，绘制各相关基因相对表达量。各实验组中ALP、OPN基因的表达量均比对照组高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。Runx2的基因表达水平在电磁场组及IL-1β+电磁场组比对照组高，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图1。

二、第7天实时定量PCR检测

实时定量PCR检测各组ALP、OPN、Runx2的表达，以GAPDH为内参，绘制各相关基因相对表达量。ALP基因在IL-1β组及IL-1β+电磁场组的表达量均比对照组低，在电磁场组的表达水平比对照组高，差异均具有统计学意义（P均＜0.05）（见图2）。OPN基因在各组的表达量均高于对照组，差异具有统计学意义（P均＜0.05）。Runx2基因在IL-1β组及IL-1β+电磁场组的表达水平均比对照组低，差异均具有统计学意义（P均＜0.05）。

三、Western blotting检测

图1 第3天ALP（a）、OPN（b）、Runx2（c）的mRNA表达水平 与对照组比较，*P＜0.05

图2 第7天ALP（a）、OPN（b）、Runx2（c）的mRNA表达水平 与对照组比较，*P＜0.05

Western blotting检测结果显示，经过3 d培养后，各实验组中OPN的蛋白表达均比对照组高（见图3 a）。其中IL-1β+电磁场组的OPN蛋白表达水平最高，提示IL-1β可以协同电磁场促进OPN的表达。各实验组中Runx2的蛋白表达均比对照组高（见图3 b），IL-1β和电磁场均促进Runx2蛋白表达。检测磷酸化的p38蛋白表达情况，发现在IL-1β和电磁场作用30、60、120 min后磷酸化的p38的表达均比0 min时高（见图4），而在加入p38抑制剂SB203580后，磷酸化的p38表达无明显变化。

讨 论

BMSCs是再生医学和组织工程研究领域常用的细胞类型，关于电磁场或IL-1β对BMSCs影响的研究较为深入。研究证实电磁场可以有效地促进BMSCs的成骨分化和细胞基质的矿化，具体效果与电磁场频率、强度、刺激时间、培养条件等因素密切相关［6］。脉冲电磁场在骨生成的早期明显促进ALP的表达，在中期则促进矿化，在后期则提高细胞数量，另外还可以影响Runx2的表达［7］。研究表明IL-1β抑制小鼠BMSCs的增殖分化，但可以促进小鼠前成骨细胞的增殖分化［8］。IL-1β抑制BMSCs的Runx2和胶原的表达，但可以提高ALP活性［9］。BMSCs可以通过激活IL-1β的受体来减缓炎症反应的进程［10］，在骨折愈合过程中具有局部及全身的抗炎作用［11］。然而，IL-1β和电磁场对BMSCs的联合作用尚未见报道。

本研究中将BMSCs经过IL-1β和电磁场作用后，使用实时定量PCR方法检测与成骨分化密切相关的指标表达，如ALP、OPN及Runx2，结果显示IL-1β干预3 d后，电磁场组和IL-1β+电磁场组的ALP和OPN的基因表达水平较对照组均有明显的提高，并且电磁场的促进作用比IL-1β更强，而IL-1β+电磁场组两者联合应用后可以发挥协同效应。Runx2基因表达水平在IL-1β组变化不明显，在电磁场组明显升高，在IL-1β+电磁场组轻微增高。Western blotting检测到OPN和Runx2蛋白的表达与其对应基因表达趋势相似。以上结果说明IL-1β和电磁场在促成骨相关基因的表达方面存在一定差异。经过7 d的刺激后，ALP的基因表达水平在IL-1β组和IL-1β+电磁场组均降低，而在电磁场组则仍是表达升高。OPN的基因表达水平在各组均升高，以电磁场组尤为明显。以上结果证明了电磁场可以促进大鼠BMSCs的成骨分化，且效应比浓度为1 ng/ml的IL-1β更明显。IL-1β在第3天促进ALP和OPN的基因表达，在第7天则抑制ALP基因表达，促进OPN的基因表达，检测结果的差异提示IL-1β的作用可能与BMSCs所处的生长阶段有关，可能在不同的细胞周期阶段，其激活的信号通路和基因不尽相同，因而所起的促成骨分化作用也会有差异。IL-1β+电磁场组在第3天的ALP和OPN基因表达均升高，IL-1β和电磁场刺激联合作用时的促进作用比单纯应用IL-1β刺激或电磁场刺激的作用均更强，而在第7天ALP基因表达较对照组和电磁场组都降低，OPN在IL-1β+电磁场组的表达低于单纯电磁场组，这一现象提示在BMSCs生长的前3 d，联合应用IL-1β和电磁场能够更好地促进其成骨分化。我们认为，早期引入电磁场的干预可以更好地促进成骨。

图3 电磁场和IL-1β作用3 d后的OPN（a）和Runx2（b）蛋白的表达

图4 电磁场和IL-1β作用2 h内的磷酸化p38蛋白的表达

p38的Western blotting结果提示在IL-1β和电磁场作用于大鼠BMSCs 30 min后，磷酸化的p38开始升高，提示p38的磷酸化通路被激活。而使用p38通路抑制剂SB203580后，磷酸化的p38表达无明显差异。以上结果说明IL-1β和电磁场通过激活了p38信号通路，参与了BMSCs成骨分化过程。

综上所述，我们认为IL-1β在电磁场刺激的协调作用下，可在早期促进ALP和OPN的表达及p38信号通路的激活。然而，本研究尚有诸多不足，我们主要研究了IL-1β和电磁场对BMSCs早期成骨效应的影响，需要进一步延长培养时间以检测后期成骨作用。另外我们还应该引入实验动物模型来分析IL-1β和电磁场对骨折愈合的具体作用，为将来电磁场的临床应用提供更多理论依据。