二氢杨梅素抗醉解酒机理研究

方 群，何东军，张 全，贺文杰，王 婷，叶 静

（成都医学院药学院，四川 成都610500）

适量饮酒具有促进血液循环、疏通经脉、助气健胃、散湿止痛等功效。但随着经济的不断发展和人际交往的增加，嗜酒人群所占比例上升，酒精所引发的疾病和问题也日益严重。研究表明人体短期内大量饮酒容易导致急性酒精中毒，从而出现头晕、恶心、呕吐等各种不适症状，急性酒精中毒己经成为节假日发病率最高的疾病之一[1]。目前，开发安全、高效的抗醉解酒制品，并研究其作用机理受到广泛重视。

二氢杨梅素（Dihydromyricetin，DMY）为藤茶中主要的黄酮类化合物,近年来其药理作用受到广泛关注。既往研究证实二氢杨梅素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗病原微生物及调血脂等多方面的药理作用。此外,二氢杨梅素还具有解除乙醇中毒，预防酒精肝、脂肪肝等作用[2-4]。为此，本文对二氢杨梅素的解酒作用进行研究，为研发新的预防酒精中毒的药物提供一定的参考。

1 实验材料

1.1 试剂

二氢杨梅素原料药（批号：20160226，武汉东康源科技）；二甲基亚砜（批号：20170103，天津市瑞金特化学品有限公司）。肝素钠（日本sigma 公司）；甲醇（色谱纯，美国MREDA 公司）；其他试剂均为分析纯，水为屈臣氏蒸馏水。

1.2 仪器

气相色谱仪（Agilent 7980B）；顶空进样器（Agilent 7697A）；压盖器；色谱柱（agilent J&W GC Columns，美国Agilent 公司）；电热鼓风干燥箱（上海-恒科学仪器有限公司）；UPT 纯水仪（优普超纯科技公司）；BS 224S 电子天平（德国Sartorius）；KH220 型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.3 实验动物

健康SD 大鼠，SPF 级，♂，3.5 月龄，体质量240～300 g，购自四川省人民医院实验动物研究所，实验动物生产许可证号：SCXK(川）2016-15]。在温度（25±2）℃自然光照射下自由进食和饮水。

2 方法与结果

2.1 DMY 混悬液的配制

精密称取适量DMY 原料药，加入适量DMSO使溶解，并用生理盐水稀释，配成终浓度为5 mg·mL-1的混悬液待用。

2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent 19091J-413:HP-5(30m×320um×0.25um) 毛细管色谱柱；进口样温度：200℃；检测器氢焰离子化检测仪（FID）温度：200℃；载气：氮气，流速12 mL·min-1恒速；分流比：10∶1；升温程序：起始温度40℃，恒温5 min 后，以26.4℃/min 直至升到250℃。顶空瓶温度：85℃加热平衡15min，LOOP 管温度：85℃，TR.LINE 温度：100℃，进样时间：0.5min。

2.3 方法学研究

2.3.1 专属性实验

取蒸馏水0.49mL 于顶空瓶中，加入80mg·ml-1乙醇水溶液10μL，最终得1.6mg·mL-1乙醇溶液，为阳性对照组；取空白血浆0.49mL 于顶空瓶中，加入蒸馏水10μL，为阴性对照组；取灌胃酒精后60min 时收集的大鼠血浆作为供试品；将阴性对照样品和供试品按照“2.2”项下色谱条件进行测定，得相应样品的色谱图（图1）。由图1 可知，在已建立的检测方法中，酒精的保留时间为0.52min，分离度好，无其它内源性杂质干扰。

图1 气相色谱图

2.3.2 标准曲线制备

取空白血浆0.49mL 分别加入浓度为80mg·mL-1，40mg·mL-1、20mg·mL-1、10mg·mL-1、5mg·mL-1、1mg·mL-1的乙醇水溶液标准系列溶液10 μL，配成一系列浓度的血浆-乙醇样品，然后条件按照“2.2”项下色谱条件进行测定，每一浓度进行3 样本分析，记录色谱图。以测得的峰面积（Y）为纵坐标，以血中酒精浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程为Y=5449.6 X-32.34（r=0.9996），血液中酒精浓度在0.02～1.6 mg·mL-1范围内时，浓度与峰面积之间线性关系良好，符合定量分析要求。

2.3.3 精密度

取10mg·mL-1、20mg·mL-1、40mg·mL-1乙醇水溶液10μL 分别加入0.49mL 血浆中，得浓度分别为0.2mg·mL-1、0.4mg·mL-10.8mg·mL-1的低、中、高浓度血浆乙醇溶液，按“2.2”项下色谱条件顶空进样进行测定，1d 内重复测定5 次，计算日内RSD。各浓度一周内重复测定3 次，计算日间精密度。日内精密度和日间精密度结果如表1所示。高、中、低3 浓度的日内RSD 分别为2.71%、6.53%、0.94%；日间RSD 分别为2.34%、5.30%、2.14%，血中乙醇的日内和日间精密度良好。

表1 血中乙醇的日内和日间精密度

2.3.4 回收率实验

将加样供试品测得的峰面积带入标准曲线方程计算测得浓度，以测得量和加入量浓度之比计算方法回收率。

分 别 取 浓 度 为10mg·mL-1、20mg·mL-1、40mg·mL-1乙醇水溶液10μL 与0.49ml 血浆混合，得0.2mg·mL-1、0.4mg·mL-1、0.8mg·mL-1的低、中、高浓度的乙醇血浆样品，照“2.2”项下色谱条件测得其峰面积。将所测得的峰面积值代入回归方程，计算得乙醇水溶液的测得浓度，以测得浓度与配置浓度之比计算相对回收率。回收率结果如表2 所示。高、中、低3 浓度的乙醇相对回收率在90%～110%范围内，符合生物样品含量测定的要求。

表2 乙醇血浆溶液的回收率(n=3)

2.3.5 稳定性实验

配制高、中、低三个浓度的乙醇血浆溶液，各配6 份，分别在常温下放置0、4、8、12h 和4℃下保存0、1、3 d 后进行测定后进行测定。不同温度下短期和长期保存条件下乙醇在血浆中的稳定性用RSD 表示，结果见表3。高、中、低3浓度的RSD 均＜8%，说明米托蒽醌在上述保存条件下稳定。

2.4 大鼠血中乙醇浓度的测定

取雄性SD 大鼠12 只，随机分为两组。实验组先以20mL/kg 剂量灌胃5mg/mL DMY 混悬液，2h 后给予50%乙醇（0.16mL/10g）；对照组先灌胃20mL/kg 的生理盐水，2h 后给予50%酒精（0.16mL/10g）。实验前禁食12 h，不禁水，分别在灌胃后5min、30min、60min，90min、180min、270min 于尾静脉采取血样0.3mL 至1.5 mL 肝素化的离心管，并转移至20mL 顶空瓶中。血浆样本按建立的乙醇检测方法进样测定，并计算血中乙醇含量。以时间为横坐标，血中乙醇浓度为纵坐标作图，结果如图2 所示。

表3 大鼠血浆中乙醇的稳定性（n=3）

图2 血中乙醇浓度-时间曲线图

由图2 可知，DMY 混悬组大鼠体内酒精含量低于对照组，说明二氢杨梅素能降低大鼠体内酒精含量，具有一定的解酒作用。

3 讨论和总结

作者参考文献[5]通过对气相升温程序进行调试，当起始温度为40℃，恒温5 min 后，以26.4℃/min直至升到250℃，主峰保留时间适宜，峰型较好，且与杂质能很好地分离。该法简单，灵敏，专属性强，能够很好的测定血中乙醇的浓度。

本研究采用了目前常用的大鼠醉酒模型，因考虑到灌服乙醇致醉后影响药物的服用问题，所以实验过程中全部采用了先灌服DMY 混悬液，后灌服乙醇溶液的方式，实验结果很大程度上体现了DMY 的防醉功效。本文虽然证实了二氢杨梅素可以降低大鼠血中乙醇浓度，但缺乏对其机理的研究，建议下一步研究二氢杨梅素对乙醇吸收的影响，并对小鼠肝脏中ADH、ALDH、SOD、GSH—Px 的酶活力的影响，从而进一步阐明二氢杨梅素解酒的机理。