蛋白酶体α6亚单位基因1233A/T位点多态性与脑梗死的关系

何芳梅，任春晓，宋春霞，高惠霞，王晶晶

1.陕西能源职业技术学院医学院康复美容教研室，陕西西安市712000；2.西安医学院第一附属医院神经内科，陕西西安市710077

泛素蛋白酶体系(ubiquitin-proteasome system,UPS)参与动脉粥样硬化全过程的调节[1]，所以UPS的基因多态性可能增加动脉粥样硬化和脑梗死的风险。蛋白酶体α6亚单位(proteasome subunitαtype 6,PSMA6)是该体系的一个重要成分，已有许多研究发现PSMA6基因-8C/G位点(rs1048990)与冠心病、心肌梗死、糖尿病、颈动脉内中膜厚度和脑卒中等相关[2-5]。而对于该基因的其他位点，目前研究却很少。由于启动子可通过影响基因表达的起始时间和程度等因素，而在基因表达方面发挥重要作用，故本文对该基因启动子1233A/T位点的多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的相关性进行研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2012年1月至2015年4月，收集西安医学院第一附属医院神经内科住院的动脉粥样硬化性脑梗死患者，均符合第四届全国脑血管病学术会议诊断标准，并经临床及CT和/或MRI确诊。共纳入病例组211例，其中男性120例，女性91例；年龄37～82岁，平均(67.6±7.2)岁。

纳入标准：①病程在1周内；②汉族。

排除标准：心脏源性脑栓塞(房颤、心瓣膜病、心肌梗死、二尖瓣脱垂、心脏粘液瘤)、腔隙性脑卒中、动脉炎、外伤、血液病、肿瘤、脑血管畸形或动脉瘤以及药物等其他原因引起的脑梗死。

取同期该院健康体检者作为对照组，均为汉族，共201例，其中男性112例，女性89例，年龄36～80岁，平均(66.4±9.0)岁；均无脑卒中史，并经过临床检查和/或影像学检查排除脑卒中。

两组性别和年龄均无显著性差异(P＞0.05)。见表1。所有标本的收集均经患者本人或其家属同意，并经西安医学院医学研究伦理委员会审核同意。

表1 两组一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 血样本的收集及全血基因组DNA的提取

取早晨空腹静脉血5 ml，3.8%柠檬酸钠抗凝，用碘化钾法提取外周血白细胞的基因组DNA，在-20℃冰箱中保存备用。

1.2.2 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)引物及限制性内切酶的设计

根据PSMA6基因1233A/T位点(DNA序列号NC_000014.9)及其两侧DNA序列，用NEBcutterV2.0(http：//tools.neb.com/NEBcutter2/index.php)设计限制性内切酶，该位点合适的限制性内切酶为MspI(MBI公司)。应用引物设计软件Primer Premier 5.0进行PCR引物序列设计，其评分不低于80分，包含实验研究的酶切位点并利于酶切结果分析的引物，并参考通用教材《医学分子生物学实验技术》中引物设计原则。引物由上海生工公司合成。

上 游 引 物 ： 5′-TAA ATG GGA GTG TGC CTT GG-3′

下 游 引 物 ： 5′-CAG GAG ATC CAG GTT GCA GT-3′

1.2.3 基因分型

PCR反应体系为15.0μl。其中包括10×Buffer 1.5 μl、dNTP(10 mmol/L)0.3 μl、上下游引物(50 pmol/μl)各 0.2 μl、基因组 DNA 0.5 μl、Taq DNA 聚合酶(5 U/μl)0.1 μl、MgCl21.2 μl、dH2O 11.0 μl。

PCR反应条件：95℃热变性5 min，95℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃40 s，扩增40个循环，72℃延伸6 min，终止反应。取PCR扩增产物10.0 μL、MspI酶0.1 μl、dH2O 3.4 μl及10×Buffer R 1.5 μl，使总体系为15.0μl。37℃酶切7 h。然后行琼脂糖凝胶电泳，150 V电泳0.5 h，观察结果。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行分析。两组间性别比例差异采用χ2检验，年龄以(xˉ±s)表示，差异采用t检验。基因型和等位基因频率采用基因计数法计算、Hardy-Weinburg平衡吻合度检测，基因型和等位基因间差异的统计分析采用χ2检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 PSMA6基因1233A/T位点检测结果

含有PSMA6基因1233A/T位点的PCR产物是191 bp，经MspI酶消化后产生两个片段分别是132 bp和59 bp。杂合子CT基因型则有三个片段，分别为191 bp、132 bp和59 bp，纯合子TT基因型则只有一个片断大小191 bp，纯合子CC基因型有2个片断大小：132 bp和59 bp。见图1。

图1 Msp I酶酶切PSMA6基因1233A/T位点扩增片段后产物电泳图

2.2 Hardy-Weinburg平衡吻合度检验

两组人群的PSMA6基因1233A/T位点的基因型分布符合Hardy-Weinburg平衡(P＞0.05)。表明该多态性位点的基因型分布在所研究的人群中达到了遗传平衡，具有群体代表性。见表2。

表2 PSMA6基因1233A/T位点基因型分布在两组人群中的Hardy-Weinburg平衡吻合度检验

2.3 PSMA6基因1233A/T位点的基因型及等位基因频率

两组CC、CT+TT基因型频率及C、T等位基因频率均无显著性差异(P＞0.05)。见表3。

表3 PSMA6基因1233A/T位点多态性与脑梗死的相关性[n(%)]

性别分层后，在男性中，两组CC(χ2=2.685,P=0.199)、CT(χ2=1.273,P=0.064)、TT(χ2=1.425,P=0.676)基因型频率及C等位基因(χ2=1.876,P=0.396)频率均无显著性差异；在女性中，两组CC(χ2=1.975,P=0.366)、CT(χ2=2.735,P=0.222)、TT(χ2=2.457,P=0.387)基因型频率及C等位基因(χ2=0.675,P=0.818)频率均无显著性差异。见表4。

3 讨论

UPS是体内代谢调节的重要因素。许多研究显示UPS通过多种途径参与动脉粥样硬化的调控。首先，核因子 κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)可以调节参与动脉粥样硬化的细胞因子和黏附分子的表达，降解炎症基因的阻滞子——IκB蛋白[1-6]。UPS可增加NF-κB活性。其次，增加的氧化应激是动脉粥样硬化重要的病理生理事件，UPS通过Nrf2在内皮细胞的氧化应激调节方面发挥着重要作用。再次，泡沫细胞是动脉粥样硬化的重要成分。通过促凋亡分子，UPS可以明显促进泡沫细胞的形成。而对于这些细胞的退化，也需要一个有功能的UPS。最后UPS还参与动脉粥样硬化发展中细胞死亡的分子调控[7]。

临床研究也提示泛素在动脉粥样硬化发生、发展中起重要作用。Divald等[1,8-9]对25例心肌梗死患者进行尸检，通过免疫组化和半定量分阶段测量等方法，发现急性心肌梗死患者动脉粥样硬化斑块中，泛素水平更高；在冠状动脉新生内膜区，发现泛素与平滑肌细胞肌动蛋白共存。在实验动物模型中，还发现药物阻滞泛素蛋白酶通路后，通过激活NF-κB，可以明显减弱脑梗死和动脉粥样硬化的发生[2,10]。

表4 1233A/T位点基因型及等位基因频率与不同性别脑梗死的相关性

真核细胞内的26S蛋白酶体是UPS的重要成分，其核心是一个20S的催化颗粒，后者由α环和β环组成。人类的PSMA6基因编码蛋白酶体α环的α6亚单位。因为UPS与动脉粥样硬化密切相关，因此PSMA6基因的改变将影响动脉粥样硬化的发生、发展。

已有许多研究显示PSMA6基因与动脉粥样硬化、高血压、2型糖尿病和心肌梗死相关[2,11-12]，有理由相信它也与缺血性脑卒中相关[13]。

Freilinger等[14]对601例德国缺血性脑卒中患者和736例对照者进行研究，发现PSMA6基因-8C/G位点与缺血性脑卒中整体和大动脉粥样硬化性卒中均呈相关性，GG基因型具有保护作用。Savchuk等[15]对102例乌克兰缺血性脑卒中患者和92例对照者运用实时PCR方法进行PSMA6基因-8C/G位点的基因型分型，发现PSMA6基因-8G/G突变体与复发性缺血性脑卒中相关。Alsmadi等[16]在1071例沙特阿拉伯冠心病患者和929例对照者组成的研究对象中，通过分子信标为基础的基因分型分析的方法，对包括KIAA0391和PSMA6在内的染色体区域14q13.2的5个SNPs位点进行分析，发现2个单倍体型，即1A-2G-3C-4A-5A和1A-2G-3G-4A-5A增加冠心病和心肌梗死的风险。

赵西耀等[17-18]研究发现，PSMA6基因rs17458312位点可能与脑梗死的发病无关，PSMA6基因rs1048990位点可能与动脉粥样硬化性脑梗死发病不相关，但P值接近有统计学意义，值得进一步研究。Zemeckiene等[19]研究发现在男性受试者中，CG PSMA6 rs1048990基因型在哮喘患者中显著高于对照组。罗冬[20]研究发现PSMA6-8C/G位点的多态性可能不是湖南汉族人群脑卒中发病的遗传易感因素。Heckman等[21]研究发现在隐性模型下，PSMA6(-C8G)基因多态性可能对缺血性脑梗死起保护作用。需要进一步的前瞻性大规模流行病学研究来证实不同人群中的这些发现。

Kakumu等[22]研究发现，PSMA6的沉默可诱导癌细胞系的凋亡或G2/M细胞周期阻滞，但不能诱导永生化正常肺细胞系的凋亡或G2/M细胞周期阻滞。这些结果提示，PSMA6是肺癌有吸引力的靶点，具有较高的治疗指数。Buraczynska等[23]证实PSMA6多态性可能是终末期肾病的保护因素。另一方面，在终末期肾病患者中，CG+GG基因型与左心室肥厚独立相关。Tamasauskiene等[24]研究发现，在立陶宛受试者中，尽管他们的蛋白酶体多态性类型不同，但预计哮喘的发生频率相同；然而，其中rs1048990 CG基因型在哮喘男性中更为普遍。常见的基因型多态性与嗜酸性哮喘表型有关。综上所述，针对PSMA6基因多态性，已有很多研究者从不同角度进行研究。因此，它的基因多态性与脑梗死之间的关系有待更深一步、更大规模的研究。

Sjakste等[25]研究发现 1233(内含子1 1233 A/T)位点的多态性与心肌梗死相关。崔少楠等[26]发现内皮型一氧化氮合酶基因第4内含子a等位基因可能是冠状动脉扩张症发病的独立危险因素。但有关该位点的研究，目前国内未见报道。内含子的功能现在还没有完全被探究清楚，但有研究显示可能与基因表达的调控有关，比如在切除一些内含子之后某些基因无法表达或者错误表达；内含子对基因的转录具有某种调控作用，比如增强作用或者影响蛋白质的功能。

本研究发现，CC、CT、TT基因型及C等位基因频率分布在两组中比较无显著性差异。性别分层后，各亚组各基因型及等位基因频率亦均无显著性差异。故该位点可能与中国汉族人群脑梗死的发病无关。目前的研究样本量不够大，同时存在抽样误差，群体代表性不完全，且可能存在遗传、种族和环境因素等作用，该基因型是否与脑梗死发病相关，还需通过加大样本量，进行多中心、不同种族的研究。