抗阻与有氧干预下SAMP8小鼠腓肠肌氧化应激响应

田鹏,周艳红,南晓洁,郑军,李海鹏

(1.山西大学商务学院,山西 太原 030031;2.山西省农业科学院,山西 太原 030031;3.浙江工业大学,浙江 杭州 310000)

0 引言

关于跑台、游泳等运动对衰老腓肠肌抗氧化能力的影响已有较多研究,但不同运动方式下不同月龄小鼠腓肠肌氧化应激的影响和抗氧化调控效应却鲜有报道。本文将爬梯运动和有氧跑台运动两种运动方式作为干预手段,对3月龄和6月龄Senescence-accelerated mice prone/8(SAMP8)快速老化小鼠腓肠肌氧化应激及抗氧化水平进行相关研究,探讨不同年龄小鼠腓肠肌的氧化应激机制和影响因素,以制定合理有效的运动干预措施,为延缓细胞衰老和肌肉质量下降、减少运动障碍综合征等提供科学依据。

1 研究方法

1.1 实验动物与分组

SAMP8小鼠系列是一类正常发育但在成熟后显示衰老加速效应的小鼠,在生长期与普通纯种小鼠无异,度过生长期后,即4～6月龄后则迅速出现行动迟缓、肌肉质量下降、脱毛且无光泽等老化特征,大量研究已证实SAMP8是衰老研究的理想模型。本研究以SAMP8雄性小鼠为研究对象,均购自山西医科大学实验动物中心(实验动物饲养许可证编号:SYXK(晋)2015-0001)。购入后于山西大学生物技术研究所动物饲养室分笼独立送风饲养,以国家标准啮齿类饲料(山西振东制药股份有限公司,许可证号:SYXK(晋)2014-0006)喂养。动物饲养室内温度25±2℃,湿度50±5%,自由进食饮水,采光为自然光。

实验动物分组如下:36只3月龄SAMP8小鼠随机分为:青年对照组(YC,n=12)、青年抗阻运动组(YR,n=12)和青年有氧运动组(YE,n=12);6月龄SAMP8小鼠36只随机分为:老年对照组(OC,n=12)、老年抗阻运动组(OR,n=12)和老年有氧运动组(OE,n=12)。

1.2 运动模型与训练方案

运动人体科学界研究认为运动主要包含两种运动形式:抗阻运动和有氧运动。抗阻运动指身体克服外加阻力,以时间短、强度高、无氧供能为主的运动形式,以达到肌肉增长和力量增加为目的。有氧运动指身体需氧量与摄氧量处于平衡状态，运动强度中等，有氧供能为主的运动形式,以提升肌肉耐力和氧化能力为目的。运动形式的差异会诱导骨骼肌的适应性发展。通过抗阻运动和有氧运动对实验小鼠进行干预,探索两种运动方式间可能存在的差异点。

1.2.1 抗阻运动方案

抗阻运动以小鼠背部负重爬梯方式进行。适应性饲养1周后开始训练,在动物的明暗周期交界时(17:00-19:00)进行训练,采取逐级递增的方式由起始负荷量25%体重增加至50%体重,以避免小鼠过量死亡。负重重量(运动负荷)和爬梯的重复次数(运动强度)(表1)分别为3次/周,3组/次,4轮/组,间隔2 min/组,20 s/轮，训练隔天进行[8]。对照组小鼠在笼内正常饲养,不进行负重爬梯运动干预。

表1 青年抗阻运动组与老年抗阻运动组爬梯运动训练方案

表2 青年有氧运动组与老年有氧运动组跑台运动训练方案

1.2.2 有氧运动方案

参照Bedford[9]跑台训练方案，并随动物跑台运动具体情况适时调整建立有氧跑台运动模型。适应性饲养1周后,选择小鼠明暗周期交界时(17:00-19:00)进行,采取恒定运动强度和负荷的方式进行,5次/周,25 min/次,每次实验后检查小鼠健康状况,如实验小鼠受伤需及时调整实验。对照组小鼠在笼内正常饲养,不进行跑台运动干预。

1.3 实验取材

分别于抗阻运动和有氧运动训练末次结束后,各组受试SAMP8小鼠12只随机抽取10只即刻断头处死。在冰盘上迅速取完整的后肢腓肠肌并称重记录后,用锡箔纸包裹标记后置于液氮中转移至-80℃超低温冰箱保存备用。

1.4 腓肠肌氧化损伤和抗氧化能力检测

加入9倍于肌肉组织重量的匀浆介质(pH7.4,0.01 mol/L Tris-HCL,0.000 1 mol/L EDTA,0.01 mol/L蔗糖,0.8%氯化钠)后使用Teflon杵棒玻璃匀浆器(Wheaton公司)匀化,匀浆速度2 000 r/min,制备成10%匀浆液后通过低温离心机(Thermo公司,4℃,2 000 r/min)离心15 min后取上清进行测定。组织中抗氧化防御体系中具有代表性的指标:总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量检测分别按照T-AOC检测试剂盒、T-SOD检测试剂盒、CAT检测试剂盒、MDA检测试剂盒(均购自南京建成生物技术所)说明书进行。

1.5 数据处理

采用SPSS 17.0软件(SPSS Inc,Chicago,USA)对实验数据进行统计分析,数据采用平均值±标准差(Mean ± SD)表示。分别采用Kolmogorov-Smirnov和Levene法进行数据分布和方差齐性检验,采用LSD法对各组进行两两比较,以不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2 结果

2.1 运动对不同月龄SAMP8小鼠腓肠肌总抗氧化能力(T-AOC)的影响

对照老年小鼠(OC)腓肠肌总抗氧化能力显著低于对照青年小鼠(YC,P<0.05)(图1)。以不同的运动方式对实验小鼠进行干预后,同龄小鼠间的总抗氧化能力差异较大;较对照青年小鼠,抗阻运动(YR)和有氧运动(YE)的小鼠腓肠肌T-AOC值显著降低,降幅分别达83%和95%;而老年小鼠的测试结果相反,抗阻运动(OR)和有氧运动(OE)的小鼠腓肠肌T-AOC值均显著高于对照老年小鼠(OC),增幅分别达429%和105%。结果显示,不同运动方式对青年和老年小鼠腓肠肌氧化应激的影响差异显著(P<0.05),同种运动方式对青年和老年小鼠腓肠肌氧化应激的影响差异也显著;青年小鼠抗阻运动组(YR)和有氧运动组(YE)小鼠腓肠肌T-AOC值均分别显著低于老年小鼠抗阻运动组(OR)和有氧运动组(OE)(P<0.05)。

Fig.1 Effects of different exercises on total antioxidant capacity (T-AOC) of gastrocnemius muscle in SAMP8 mice图1 不同运动对SAMP8小鼠腓肠肌总抗氧化能力(T-AOC)的影响

2.2 不同运动对SAMP8小鼠腓肠肌总超氧化物歧化酶(T-SOD)的影响

对照老年小鼠(OC)腓肠肌T-SOD活性显著低于对照青年小鼠(YC,P<0.05)(图2),随着小鼠年龄的增加其腓肠肌T-SOD活性呈下降趋势。以不同的运动方式对实验小鼠加以干预后,其腓肠肌T-SOD活性在同月龄小鼠上也表现出不同差异;抗阻运动(YR)和有氧运动(YE)的小鼠腓肠肌T-SOD值显著低于对照青年小鼠(YC)(P<0.05),降幅分别为70%和66%。YR组与YE组间差异不显著;较对照老年小鼠(OC),抗阻运动(OR)和有氧运动(OE)小鼠腓肠肌T-SOD活性显著升高,增幅分别达458%和342%,且OR组显著高于OE组(P<0.05)。

Fig.2 Effects of different exercises on the total superoxide dismutase (T-SOD) activity of gastrocnemius muscle in SAMP8 mice图2 不同运动对SAMP8小鼠腓肠肌总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性的影响

2.3 不同运动对SAMP8小鼠腓肠肌过氧化氢酶(CAT)的影响

运动方式与年龄均可对小鼠腓肠肌CAT活性产生显著性影响。如图3所示,对照青年小鼠腓肠肌CAT活性显著高于对照老年小鼠(OC)(P<0.05)。随小鼠年龄升高,CAT活性显示出与SOD相同趋势。经不同运动方式干预后,同龄小鼠腓肠肌CAT活性显示出显著性差异(P<0.05);抗阻运动组(YR和OR)的CAT活性均显著高于各自对照小鼠(YC和OC),且YR组也显著高于同龄的YE组(P<0.05),但OR组与老年小鼠有氧运动组(OE)组间差异不显著(P>0.05)。

Fig.3 Effects of different exercises on catalase (CAT) activity of gastrocnemius muscle in SAMP8 mice图3 不同运动对SAMP8小鼠腓肠肌过氧化氢酶(CAT)的影响

2.4 不同运动对SAMP8小鼠腓肠肌丙二醛(MDA)的影响

对照老年小鼠(OC)腓肠肌丙二醛(MDA)含量显著高于对照青年小鼠(YC,)(图4)(P<0.05),表明小鼠细胞损伤随年龄增大呈升高趋势。经过两种不同方式的运动干预之后,抗阻运动青年小鼠组(YR)、抗阻运动老年小鼠组(OR)和有氧运动老年小鼠组(OE)MDA含量均显著高于各自对照组(P<0.05),但有氧运动青年小鼠组(OE)MDA含量却低于对照,表明有氧运动对青年小鼠腓肠肌细胞的损伤减轻。

Fig.4 Effects of different exercises on malondialdehyde (MDA) levels of gastrocnemius muscle in SAMP8 mice图4 不同运动对SAMP8小鼠腓肠肌丙二醛(MDA)含量的影响

3 讨论与结论

超氧阴离子自由基作为细胞代谢过程中的中间产物,对机体的影响具有双重性。ROS可直接与脂肪、核酸等反应而引起脂质过氧化作用,从而对机体的组织器官产生毒性作用，其中MDA作为脂质过氧化的产物,其常作为细胞氧化损伤的重要检测指标。本项研究通过测定小鼠腓肠肌MDA含量,研究了负重爬梯和动物跑台两种运动方式对不同月龄SAMP8小鼠组织细胞氧化损伤的影响程度。结果表明,小鼠体内氧化应激水平与年龄和运动方式显著相关,显示不同运动方式均可导致细胞损伤。此外,研究发现有氧运动青年小鼠组MDA含量低于对照,这与晁敏等[10]研究结果基本一致。抗阻运动较有氧运动在短时间内能量消耗较高,活性氧利用率相应增加,导致脂质过氧化产物(MDA)含量升高。虽然有氧运动可同样导致小鼠腓肠肌有氧代谢增强并产生大量活性氧,但机体对自由基的利用也相应增加,如以通过诱导谷胱甘肽硫转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶等酶活性升高、促进凝血酶原和胶原蛋白的合成等方式增强抗氧化防御系统并强化细胞修复功能等[11]。当机体对活性氧自由基的利用速率大于其生成速率时,将会导致脂质过氧化产物减少。

为防止并缓解活性氧对机体的氧化损伤,生物体在长期的进化过程中形成并完善了一套抗氧化系统和活性分子以清除过多的ROS,如还原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽硫转移酶(GSH-Px)和谷胱甘肽过氧化物酶(CAT)等,其中总抗氧化能力(T-AOC)是生物体防御氧化损伤能力强弱的重要指标。通过对小鼠腓肠肌的总抗氧化能力(T-AOC)进行检测,有利于从整体上把握腓肠肌的氧化应激水平。结果表明,T-AOC表现为年龄依赖性,且与运动方式具较高相关性。经长时间运动干预后,青年小鼠腓肠肌血氧供应能力增加,细胞氧化磷酸化水平提升,细胞耐受能力及代谢水平逐渐处于较为旺盛阶段。腓肠肌细胞代谢水平和质量得到显著提升后引发了细胞对运动干预的适应性发展,导致氧化应激水平相应改变,参与有氧代谢的酶活性增强,导致了T-AOC下降这一结果[12]。老年小鼠通过8周的运动干预,促使其已发生退行性综合征的老年小鼠腓肠肌的机械负荷得到加强,诱发腓肠肌线粒体保持较高的呼吸率,减少腓肠肌纤维的线粒体损伤,并维持在其氧化能力的临界阈值之上,导致了老年小鼠腓肠肌抗氧化防御能力上调的保护性反应[13]。老年小鼠腓肠肌T-AOC上升是运动干预后导致的诱导型上调,是基于腓肠肌组织自身的保护性反应。

SOD在机体氧化与抗氧化平衡中起着至关重要的作用,可通过清除ROS保护细胞免受氧化损伤[14]。本研究发现,8周的运动干预促使青年小鼠腓肠肌的SOD活性显著降低。Allan等研究认为长期运动可诱使机体自身代谢速率和超氧阴离子自由基利用率的增加,加快氧阴离子自由基的代谢速率,导致超氧阴离子自由基减少[15]。肌肉退行性变化是老年小鼠在运动干预后腓肠肌SOD活性上升的重要内部诱因。外部运动干预则通过诱发SOD等具有抗氧化蛋白的上调表达介导了老年小鼠抗氧化防御能力增强的保护性反应[16]。此外,机体组织中CAT是机体在抗氧化过程中另一重要因子。CAT可直接分解H2O2降低其在组织中的浓度,以防止H2O2与O2反应生成有害的-OH,防止细胞过氧化作用的发生[17]。研究发现,OE、OR和YR组小鼠CAT活性均显著高于对照,而YE组较对照则无显著差异。其原因可能在于抗阻运动在短时间内能量消耗增多,氧利用率增加,代谢产物增加,在氧供应受限的情况下,诱发了机体过氧化氢酶对底物H2O2的分解,释放出O2供机体放能,增加了对氧的利用效率；而有氧运动能量消耗平缓,自身氧供应能保证机体对氧的利用,所以有氧运动没有使过氧化氢酶应激反应发生明显变化。

本实验通过负重爬梯和动物跑台模型,研究了不同时期SAMP8小鼠在不同运动方式下其腓肠肌氧化损伤程度及抗氧化酶活性变化。研究显示不同年龄小鼠以不同策略缓解机体受到的氧化损伤。其中青年小鼠抗氧化能力的增强是以提升自身质量为主,且有氧运动要比抗阻运动效果明显;而老年小鼠抗氧化能力的提升是以被动诱导上调为主。两种运动方式均有利于抗氧化能力的增强,但抗阻运动导致的氧化损伤程度显著高于有氧运动,提示中老年人群的运动方式应以有氧运动为主,坚持长期适量的有氧运动有利于增强机体抗氧化酶的活性,降低机体的氧化损伤和细胞毒害作用。