正交试验、响应面法优化加味三根汤的提取工艺比较△

李华妮，郑连营，葛文静，王艳艳，刘长河*

1.河南省中医药研究院，河南 郑州 450004；2.河南省儿童医院/郑州大学附属儿童医院/郑州儿童医院，河南 郑州 450003

加味三根汤由西洋参、蒲公英、鲜白茅根和鲜芦根药食两用中药组成，民间常用于预防感冒、小儿春季流行病。经过有关部门检测，其水提取物具有提高机体免疫力作用。方中主药西洋参具有抗氧化、抗肿瘤、调节血糖、提高免疫力、保护心血管系统等功效[1-4]。西洋参的主要活性成分为总皂苷，其中人参皂苷Re、Rb1、Rg1的含量较高[5]。白茅根主要含有黄酮类、糖类、有机酸类、三萜类等化合物，具有凉血止血、调节免疫、抗氧化、抗肿瘤等作用[6]。芦根为禾本科植物芦苇的根茎，也是一种常见的中药，其含量较大的是多糖类成分，还含有酚酸类、甾体类、黄酮类和蒽醌类等成分，具有抗氧化和保肝的作用[7-8]。蒲公英中主要成分有黄酮类、酚酸类、萜类及倍半萜类化合物，具有抗炎、抗肿瘤和抑菌等作用[9-10]。目前，关于加味三根汤的提取工艺研究还未见报道。

为了更好地开发该汤剂，得到安全、有效的保健食品，本实验以总皂苷提取量为评价指标，采用正交试验和响应面法优选加味三根汤的提取工艺，并将两种方法进行比较，确定适宜的提取方法，为加味三根汤的生产提供参考。

1 材料

1.1 仪器

紫外吸光光度计(岛津，日本)；XAD205DU电子分析天平(德国METTLE TOLEDO公司)。

1.2 材料

人参皂苷Re(中国食品药品检定研究院，批号：110754-200822)；其余试剂均为分析纯。

西洋参、蒲公英、鲜白茅根、鲜芦根等药材购于平顶山市仲华堂中药饮片有限公司，由河南省中医药研究院张留记研究员鉴定分别为五加科人参属多年生草本植物的干燥根、菊科植物蒲公英的干燥全草、禾本科植物白茅的新鲜根茎和禾本科植物芦苇的新鲜根茎。

2 方法

2.1 总皂苷测定方法的建立

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Re对照品8.1 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 加味三根汤提取液的制备 按处方量(西洋参9.0 g、鲜白茅根50 g、鲜芦根50 g、蒲公英17.5 g)称取药材，用适量的水煎煮一定的时间，煎煮两次后将提取液合并，浓缩至约1000 mL，转移至1000 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，静置，作为储备液。

对照试验：按处方量(鲜白茅根50 g、鲜芦根50 g、蒲公英17.5 g)称取药材，去掉西洋参，用适量的水煎煮一定的时间，煎煮两次后将提取液合并，浓缩至约1000 mL，转移至1000 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，静置，作为储备液。

2.1.3 测定方法 按照保健食品中总皂苷的含量测定方法(《保健食品检验与评价技术规范(2003年版)》)进行测定[11]。用10 mL注射器作层析管，内装3 cmAmberlite-XAD-2大孔树脂，上加1 cm中性氧化铝。先后用25 mL 70%乙醇和25 mL水洗柱，弃去洗脱液，精确加入1.0 mL已处理好的储备液，用25 mL水洗柱，弃去洗脱液，然后用25 mL 70%乙醇洗脱，收集洗脱液于蒸发皿中，低温挥干，加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液、0.8 mL高氯酸，于60 ℃水浴上加热10 min，取出，冰浴冷却后，准确加入冰乙酸5.0 mL，混匀后，在400～800 nm波长进行扫描，根据扫描图谱(见图1)，最终选取在560 nm波长处测定吸光度。

注：A.对照品溶液 B.供试品溶液 C.阴性对照品溶液。图1 对照品及样品波长扫描图

2.1.4 标准曲线的绘制 分别精密吸取上述人参皂苷Re对照品溶液10、20、40、60、80、100 μL至蒸发皿中，低温挥干，用水1 mL使溶解。按2.1.3项下方法测定吸光度。标准曲线以人参皂苷Re浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行线性回归，标准曲线为Y=0.020 9X+0.017 1，r=0.995 4，表明人参皂苷在2.7～27.0 mg·L-1线性良好。

2.1.5 方法学考察 专属性实验表明，阴性对照对总皂苷的测定无干扰，该测定方法精密度良好(RSD为1.21%)，重复性较好(RSD为1.58%)，平均加样回收率为98.10%，RSD为1.01%，供试品溶液在24 h内稳定性良好(RSD为1.07%)，精密吸取加味三根汤提取液1 mL，低温挥干，残渣加水1 mL使溶解，按照2.1.3项下的方法进行测定。由外标一点法计算样品中的总皂苷浓度，再按公式计算总皂苷含量。

(1)

2.1.6 正交试验设计 根据预实验结果，以提取次数(A)、提取时间(B)、液料比(C)为考察因素，选用L9(34)正交表进行试验，因素水平见表1。正交试验采用电热套加热烧瓶内回流提取，煎煮过程水分不损失，与生产过程相似。

表1 正交试验因素与水平

2.1.7 响应面试验设计 利用Box-Behnken响应面法的设计原理，以提取次数、提取时间、液料比为自变量，确定响应面试验各参数，见表2。

表2 响应面试验因素与水平

2.1.8 数据统计与分析 采用SPSS软件对正交试验数据进行统计分析；采用Design expert 8.0.6软件对响应面试验数据进行分析。

3 结果与分析

3.1 正交试验的结果与分析

正交试验采用电热套加热烧瓶内回流提取，煎煮过程水分不损失，与生产过程相似。以总皂苷的含量为指标，进行分析，结果及方差分析见表3～4。

表3 正交试验结果

表4 方差分析

注：F0.05(2，2)=19，*差异有统计学意义；F0.01(2，2)=99，**差异有统计学意义。

表3中的K1、K2、K3分别表示每个因素的3次试验所得的总皂苷含量的平均值，R表示平均数的极差。由表3极差R可得到各因素对总皂苷含量的影响顺序为提取次数>液料比>提取时间。由表4方差分析结果可知，提取次数对总皂苷含量的影响较显著，提取时间和液料比对总皂苷含量的影响则不显著。直观根据3个因素的K1、K2、K3，确定最佳提取工艺为A2B2C3，即水提取正交试验最佳提取工艺为：液料比10∶1，提取2次，每次1.5 h。根据最佳提取条件进行验证实验，所得总皂苷质量分数的平均值为2.90 mg·g-1(RSD=2.1%)，总皂苷含量数据稳定，提示工艺稳定可靠。

3.2 响应面试验结果与分析

3.2.1 响应面试验结果 在正交试验的基础上，利用Box-Behnken响应面法的设计原理，以提取次数、提取时间、液料比为自变量，以总皂苷的含量为响应值设计3因素3水平(17个试验点)的响应面分析试验，这17个试验点分为12个析因点(表中编号1～3、5～7、9～10、14～17)和5个中心点(表中编号4、8、11～13)，试验的方案及结果见表5。

表5 Box-Behnken设计与结果

表6 方差分析

3.2.2 模型的建立和显著性分析 采用Design-Expert 8.0.6.1响应面分析软件对表5中的17组试验数据进行分析，得到的二元回归方程：Y=3.204+0.198 75A-0.021 25B+0.045C+0.027 5AB-0.075AC+0.03BC-0.263 25A2+0.021 75B2-0.105 75C2。由表6方差分析结果可知，模型差异有统计学意义(P<0.01)，失拟项不显著(P>0.05)，以上数据充分说明了该模型的拟合度较好，可以用该模型表示响应值(总皂苷的含量)与自变量(提取次数、提取时间、液料比)间的多元回归关系。在各个作用因素中，一次项提取次数差异有统计学意义(P<0.01)，提取时间、液料比差异无统计学意义，并且3个影响因素的交互作用不显著，并由表6中的F值可知，各因素对总皂苷含量的影响顺序为提取次数>液料比>提取时间，所得的结论与正交试验是相符的。二次项中，只有A2(提取次数和提取次数交互作用)差异具有统计学意义，其余均没有统计学意义。

3.2.3 响应面的交互作用分析 在提取次数、提取时间、液料比3个因素中任意取两个分别作为X和Y，以总皂苷的含量作为Z，采用Design-Expert 8.0.6.1响应面分析软件作出相应的三维图。通过响应面和等高线可以直观的分析因素的交互作用对总皂苷含量的影响。在响应面图中，曲面表现越陡峭，则该因素对总皂苷含量的影响越大[12-14]；由图2可知，提取次数和液料比对总皂苷含量的影响较大，表现为随着提取次数和液料比的增加或减少，总皂苷含量变化较大。提取时间对总皂苷含量的影响较小，表现为随着提取时间的增加或减少，总皂苷含量变化较小。提取次数和提取时间(图2A)、提取时间和液料比(图2C)的响应曲面表现的较为平滑，说明这些因素的交互作用不明显；提取次数和液料比的响应面(图2B)表现的比较陡峭，并且其等高线图也最接近椭圆形，说明这两个因素间的交互作用较强。由此可见，提取次数和液料比对总皂苷含量的影响较大，提取时间对总皂苷含量的影响较小，但是提取时间对总皂苷含量也有一定的协同作用。

图2 两因素交互作用对总皂苷含量的响应面图

3.3 最佳条件的确定及验证

通过Design-Expert 8.0.6.1响应面分析软件求解回归方程，得到加味三根汤的最佳提取条件是：液料比8.42∶1，提取2.4次，每次2 h，在此提取条件下所得的理论总皂苷质量分数为3.30 mg·g-1，为方便实验操作，将上述提取条件修正为液料比8∶1，提取2次，每次2 h进行验证实验，平行3次所得的总皂苷质量分数的平均值为3.21 mg·g-1(RSD=1.11%)，与理论总皂苷提取值相差2.7%，由此可见，该多元二次方程建立的响应面模型预测总皂苷含量是可行的。

4 讨论

本研究采用的是《保健食品检验与评价技术规范(2003年版)》中总皂苷的含量测定方法，其精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验的RSD分别是1.21%、1.07%、1.58%、2.31%，以上数据说明仪器的精密度良好，加味三根汤供试品溶液稳定性较好，该方法用于总皂苷的测定是可行的。此外，扣除掉西洋参药材，其他3种药材同法制备成供试品溶液，结果表明鲜白茅根、鲜芦根和蒲公英对总皂苷的测定无干扰。

正交试验最佳提取工艺为：液料比10∶1，提取2次，每次1.5 h，所得总皂苷质量分数的平均值为2.90 mg·g-1。响应面法得到加味三根汤的最佳提取条件：液料比8∶1，提取2次，每次2 h，所得的理论总皂苷质量分数为3.21 mg· g-1，响应面法的液料比(8倍量)小于的正交试验法液料比(10倍量)，其提取时间(4 h)则大于响应面法的加热时间(3 h)，所以两种方法生产耗能基本相同。两种方法得到的结论也是基本一致的：提取次数对总皂苷含量影响显著，各因素对总皂苷含量的影响顺序为提取次数>液料比>提取时间，但是响应面法提取的总皂苷含量较正交试验法提高了10.7%，更适合加味三根汤提取工艺。

在正交试验中，提取次数对总皂苷含量的影响差异有统计学意义(P<0.01)，提取时间、液料比则不显著，但是在响应面法中还发现提取次数和液料比存在较强的交互作用，对总皂苷含量的影响较大，因此这3种因素对总皂苷含量的影响不是简单的线性关系。因此，两种方法相比较，响应面法能更好地解释多因素与响应值之间的关系，特别是因素之间存在交互作用的。在当前的药材提取工艺研究中，正交试验的应用较多[15-18]，该方法得出的结果直观易分析，但是它得到的优选值，只能是试验所用水平的某一种组合，具有局限性。响应面法是将一系列的实验数据用多项式进行拟合，得出回归方程，然后将函数以图形的方式表现出来，从而能直观地分析出各个因素与响应面之间的关系以及因素之间的交互关系。所以响应面法用于多因素影响的提取工艺分析更为科学、合理。