上海地区柑橘黑点病发生现状与侵染来源分析

2019-08-21任节红上海市崇明区林业站202150

上海农业科技 2019年4期

任节红（上海市崇明区林业站 202150）

上海地区是我国适合柑橘栽培的最北缘地区，现有柑橘种植面积约4 000 hm2，主要集中在崇明三岛。近年来，柑橘黑点病（也称树脂病、砂皮病）在上海地区的发生逐年加重，已成为影响当地柑橘果品质量和商品价值的最主要病害。为了解上海市柑橘黑点病侵染来源，从而为黑点病的防治提供科学依据，笔者于2013—2014年进行上海地区柑橘黑点病发生现状与侵染来源分析。现将相关结果报道如下。

1 上海地区柑橘黑点病发生现状

柑橘是南方地区最主要的水果之一，主要栽培于长江以南各省（市），上海地区是适合柑橘栽培的最北缘地区。上海市柑橘生产主要集中在崇明三岛，其柑橘种植面积占全市种植总面积的80%以上，在南汇、奉贤、金山、青浦等区也有一定的种植面积。据统计，2012 年，上海市柑橘投产总面积达7 000 hm2，总产量为2.13×105t，总产值达2.5 亿元。

目前，上海地区柑橘栽植品种主要为温州蜜柑早熟品种“宫川”，其他还有少量“宫本”“兴津”“尾张”等品种种植；柑橘树的树龄大多在20～30年之间，树龄较老，橘树株行距多为3 m×3.5 m、3 m×3 m，也有少数株行距为2 m×2.5 m。上海地区橘园土质为黄夹沙土，橘园防风林带多为水杉和法国冬青，但大多数橘园田间管理粗放，病枝、枯枝随处可见，病害普遍发生。

近年来，柑橘黑点病在上海地区的发生逐年加重，如1999年上海地区柑橘黑点病大发生，2009年崇明区长兴岛前卫农场的柑橘黑点病再度大面积发生，2012年崇明三岛柑橘黑点病全面爆发，果实平均感病率在30%左右，果实商品价值大大降低。

2 上海地区柑橘黑点病侵染来源分析

2.1 试验方法

2.1.1 橘园取样

为明确柑橘树体各部位及橘园周边防护林上柑橘黑点病的侵染来源，选择上海前卫柑橘公司的常年柑橘黑点病发生严重的橘园及其周边防护林。于2014 年6 月29 日进行采样，采样对象为：CA，“宫川”病叶；CB，枳枯枝，CC，“宫川”叶；CD，香樟枯枝；CE，法国冬青枯枝；CF，水杉枯枝；CG，“宫川”花；CH，“宫川”病树皮；CI，“宫川”枯枝；CJ，“宫川”幼果。将采集的10 种样本，按照DNA提取方法获得DNA，用于后续检测。

2.1.2 DNA 提取方法

鉴于腐生微生物和病原菌均存在于植物体表，选取样本各200 g，每个样本各2 份；每份加2 mL去离子无菌水，室温下浸泡30 min；在旋涡振荡器上振荡10 min；收集液体1000 μL；选用真核生物DNA 试剂盒(广州美基生物科技有限公司)，按照手册DNA提取方法提取总的DNA，定容至50 μL；取1 μL 进行电泳检测，标记含量；其余放置在-80℃的低温冰箱中保存备用。

2.1.3 引物设计

柑橘黑点病的病原是柑橘间座壳菌[1]。按照Feng Huang、D. Udayanga、R.R. Gomes 等人所用引物设计引物（分别以病菌的延伸因子EF 基因、微管蛋白tubulin 基因、16SRNA 转录间隔区为靶标设计引物），主要检测柑橘黑点病病菌的16 SRNA 转录间隔区。见表1。

表1 柑橘黑点病病菌PCR检测所用引物

2.1.4 PCR 体系

按照表2 中PCR 体系进行基因PCR 扩增；PCR仪购自德国eppendorf公司；PCR扩增条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，52 ℃复性30 min，℃，再倒入加有适量EB 的模具中，搅拌均匀，插入塑料梳子，自然冷却约30 min后，取出样孔梳，将凝胶置于盛有相同浓度的TAE 缓冲液的电泳槽中，将DNA 样品与适量6×Loading Buffer 混合，吸取适量加入点样孔，电泳至溴酚蓝带移到凝胶的2/3处，取出凝胶，在凝胶成像系统下观察并用刀片切下所需要的条带。

表2 柑橘黑点病病菌PCR体系

2.2 结果与分析

图1 柑橘“宫川”及周边防护林柑橘黑点病病菌的DNA凝胶电泳结果

由图1 可知，来源于柑橘“宫川”病叶（CA）、香樟枯枝(C D)、法国冬青枯枝(C E)、水杉枯枝（CF）、“宫川”花（CG）、“宫川”病皮（CH）和“宫川”枯枝（CI）的gDNA的PCR电泳结果可看出明显的gDNA 条带，其中“宫川”花（CG）来源的gDNA 含量丰富，而“宫川”幼果（CJ）几乎看不出有明显的gDNA 条带。这表明凡是gDNA 条带明显的样品，均有可能含有柑橘黑点病病菌。

以上述样品的gDNA 为模板，以病菌的延伸因子EF 基因为靶标设计引物进行PCR 扩增。由图1可知，在500 bp 位置仅显示香樟枯枝（CD）、法国冬青枯枝（CE）、“宫川”花（CG）和“宫川”枯枝（CI）有PCR 产物，而且条带大小不一。同时，测序显示，仅“宫川”枯枝（CI）的PCR 产物吻合柑橘黑点病病菌EF基因的序列。这表明，以病菌的延伸因子EF 基因为靶标，采用PCR 检测不同样品的柑橘黑点病病菌存在与否，并不是有效的检测方法。

以上述样品的gDNA 为模板，以病菌的微管蛋白tubulin 基因设计引物进行PCR 扩增。由图1 可知，在500 bp大小处显示条带的样本有柑橘“宫川”病叶（CA）、枳枯枝（CB）、“宫川”叶（CC）、香樟枯枝(CD)、法国冬青枯枝(CE)、水杉枯枝（CF）、“宫川”花（CG）、“宫川”病皮（CH）和“宫川”枯枝（CI），同时，460 bp 处的条带经测序，显示为不正确条带。这表明，除健康幼果外，均可从样72 ℃延伸30～60 s，32 个循环，最后72 ℃延伸10 min。

2.1.5 DNA 凝胶电泳

采用1%的琼脂糖凝胶电泳，即在100 mL 1 000倍的TAE 缓冲液中加入琼脂糖1.0 g，在微波炉中高火条件下加热2～3 min至沸腾，并使琼脂糖凝胶充分溶解至溶液澄清，然后在室温下冷却至约60本中检测出柑橘黑点病病菌。因此，无论是柑橘还是防护林，其残体部分均是柑橘黑点病的侵染来源。

以上述样品的g DNA为模板，以病菌的1 6 SRNA 转录间隔区为靶点设计引物进行PCR 扩增。由图1可知，在550 bp处均能显示条带，而大于550 bp的条带经测序验证是非特异性条带。这表明，除健康幼果外，均可从样本中检测出柑橘黑点病病菌。由此说明，柑橘黑点病的侵染来源主要是来自柑橘及周边防护林的枯枝[2-4]。