喉鳞状细胞癌及癌前病变R0切除术后复发危险因素研究*

鲁海珍，尹英爱，吕宁

100021 北京，国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院 病理科(鲁海珍、吕宁)；102401 北京，首都医科大学良乡教学医院 病理科(尹英爱)

喉癌的主要治疗方法是手术和放疗，初治后复发并不少见，给患者带来后续治疗的痛苦，影响患者的生存质量和生存期，也给临床治疗带来挑战。如何筛选与复发相关的危险因素，是头颈领域研究者奋斗的方向之一[1]。喉癌的组织学类型绝大部分是鳞状细胞癌(文中简称喉癌)，癌前病变为鳞状上皮中-重度不典型增生、原位癌。影响喉癌术后复发的因素复杂多样[2]。为探讨喉癌复发的相关因素，我们回顾性分析95例喉癌及癌前病变患者的病例资料，分析肿瘤分子标志物(包括p53、c-Myc、PTEN、survivin、p21和p27)表达情况及临床病理因素与喉癌复发的相关性。

1 材料与方法

1.1 标本来源

通过中国医学科学院肿瘤医院病案室编目组、病理科数字档案管理系统进行统计，自1999年1月至2015年12月喉癌、声带鳞状上皮不典型增生、原位癌共608例，期间58例患者术后3年内复发，复发率9.5%(58/608)。入排标准为：喉癌及癌前病变根治性R0切除术后3年内复发的病例入组，优选早期病例；初次手术切缘阳性术后复发或肿瘤组织过小无法进行免疫组化检测的病例排除。经筛选，最终入复发组41例。作为对照，将未复发的早期喉癌或不典型增生、原位癌病例54例入组对照组，共95例。所有标本均经10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋，4μm涂胶白片以备免疫组化检测。

1.2 免疫组化方法

肿瘤涂胶白片75℃烤箱30分钟，脱蜡至水。用PTLINK设备进行抗原修复，97℃烤箱23分钟，阻断液室温封闭10分钟，PBS冲洗3分钟；一抗孵育：滴加一抗(p21、p27、survivin、c-Myc、p53和PTEN)工作液，室温孵育40 分钟；PBS冲洗3分钟。二抗室温孵育20 分钟，PBS冲洗3分钟； DAB显色，清水冲洗终止显色，苏木素复染，1%盐酸乙醇分化，氨水返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。修复液、阻断液及二抗等试剂均采用DAKO公司Envision 产品。根据肿瘤细胞着色强度和比例相乘结果对免疫组化结果评分进行分组，具体如下：着色肿瘤细胞比例按<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%和≥75%分为0～4分，着色强度按未着色、淡黄、浅棕和深棕分为0、1、2、3。以二者相乘分数(0～12)，分为4组，阴性组≤1分，弱阳性组2～3分，中阳性组4～7分，强阳性组≥8。若按阴性和弱阳为一组，而中阳和强阳为一组，分为两组表达，进一步分析。一抗信息详见表1。

表1 免疫组化抗体列表

Table 1. Immunohistochemistry Antibodies

First antibody (Clone)First antibody incubation timeIncorporatedCategory numberPositive locationp21 (DCS-60.2)40 minsZSGB-BIOZM-0206Nuclearp27 (EP104)40 minsZSGB-BIOZA-0557NuclearSurvivin (EP119)40 minsZSGB-BIOZA-0530Nuclearc-Myc (Y69)40 minsMXBRMA-0664Nuclearp53 (DO-7)40 minsMXBKIT-0010NuclearPTEN (6H2.1)40 minsDAKOM3627Cytoplasm

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行统计学数据处理，计数资料使用卡方检验或Fisher 精确检验，以P<0.05具有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床病理基本信息

复发组全部为男性，平均年龄(65±10.9)岁；声门上型5例，声门型36例；病理显示不典型增生2例，原位癌3例，高、中、低分化者分别为8、22、6例；肿瘤病理T分期：pTis 3例，pT1 22例，pT2 11例，pT3 3例；肿瘤病理N分期：pN0 15例，pN1 7例，pN2 5例，未行淋巴结清扫14例；吸烟者36例，酗酒者24例，不饮酒或偶饮酒17例。未复发组男51例，女3例，平均年龄(65±8.5)岁；病理显示原位癌24例，高、中、低分化为12、15、3例；肿瘤病理T分期：pTis 24例，pT1 29例，pT2 0例，pT3 1例；肿瘤病理N分期：pN0 53例，pN1 1例；吸烟者50例，酗酒者27例，不饮酒或偶饮酒27例 (详见表2)。

表2 95例入组患者临床病理信息

Table 2. Correlation between Clinical Pathology and Tumor Recurrence in 95 Cases of Laryngeal Carcinoma

VariableRecurrence group (%)Nonrecurrence group (%)Correlation, P∗AgeAverage (y)6565>0.05Median(y)6464GenderMale41(100)51(94.4)0.179Female03(5.6)SmokeYes36(87.8)50(92.6)>0.05No5(12.2)4(7.4)Drink alcoholYes24(58.5)27(50.0)>0.05No or a little17(41.5)27(50.0)DifferentiationSquamous CAWell8(19.5)12(22.2)<0.001Intermidiate22(53.7)15(27.8)Poor6(14.6)3(5.6)Cacinoma in situ3(7.3)24(44.4)Atypical hyperplasia2(4.9)0pTTis3(7.3)24(44.4)Non-random selection, not applicableT122(53.7)29(53.7)T211(26.8)0T33(7.3)1(1.9)Atypical hyperplasia2(4.9)0pNN015(36.6)53(98.1)Non-random selection, not applicableN17(17.1)1(1.9)N25(12.2)0NX14(34.1)0SiteSupraglottis5(12.2)42(77.8)0.161Glottis36(87.8)12(22.2)

*Fisher exact test.

2.2 临床病理与肿瘤复发的关系

肿瘤复发与肿瘤分化相关，分化差的喉癌复发率更高，结果具有统计学意义(P<0.001，Fisher精确检验，表2)，具体为中-低分化喉癌复发病例28例(60.8%)，未复发18例；高分化喉癌复发病例8例(40.0%)，未复发12例；原位癌复发3例(11.1%)，未复发24例。因入组病例为非随机筛选，未复发组主要选择的是原位癌和早期喉癌，故对于肿瘤病理分期与肿瘤复发相关性无法判断(表2)。对本组病例中的pT1期病理进行复发与未复发组对比，未发现鳞状细胞癌的分化与肿瘤复发有关，因此这一结果还有待进一步验证(表3)。无论是95例病例的比较还是51例pT1期的复发与未复发两组的比较，均未发现肿瘤复发与患者性别、年龄、是否吸烟、酗酒及部位相关(P>0.05， Fisher精确检验)。

2.3. 免疫组化检测结果

2.3.1 肿瘤复发与c-Myc表达(图1A)的相关性 依据方法中的免疫组化评分，按阴性、弱到强阳性表达分为4组(有1例患者的切片中未观察到肿瘤)，肿瘤的复发与c-Myc蛋白表达强弱相关，复发组病例中36例(87.8%)呈强表达，而未复发组的强表达比率是64.2%，肿瘤复发与c-Myc表达显著相关(P=0.016，Fisher精确检验，表4)。本组pT1的病例中复发与未复发肿瘤c-Myc的表达具有同样结果(P=0.047，Fisher精确检验，表6)。

表3 T1期喉癌的临床病理信息

Table 3. Correlation between Clinical Pathology and Tumor Recurrence in T1 Laryngeal Carcinoma Patients

VariableRecurrence group (%)Nonrecurrence group (%)Correlation, PAge≥6511(50)12(41.4%)0.371<6511(50)17(58.6%)GenderMale22(100)29(100%)Not calculatedFemale00SmokeYes18(81.8)28(96.6)0.669∗No4(18.2)1(3.4)Drink alcoholYes13(59.1)15(51.7)0.406No or a little9(40.9)14(48.3)DifferentiationSquamous CAWell6(27.3)12(41.4)0.561∗Intermidiate14(63.6)15(51.7)Poor2(9.1)2(6.9)pNN011(50)28(96.6)<0.001∗N13(13.6)1(3.4)N23(13.6)0NX5(22.7)0SiteSupraglottis4(18.2)10(34.5)0.165Glottis18(81.8)19(65.5)

*Fisher exact test.

图1 喉癌及癌前病变免疫组化表达×100

Figure1.ImmunohistochemicalExpressionofMarkersinLaryngealCarcinomaandPrecancerousLesions(×100)

A. c-Myc, located on nuclear, tumor cells are strong positive; B. Survivin, located on nuclear, tumor cells are median positive; C. PTEN, located on cytoplasm, precancerous lesion cells are weak positive; D. p21, located on nuclear, tumor cells are strong positive; E. p27, located on nuclear, tumor cells are strong positive; F. p53, located on nuclear, tumor cells are strong positive.

2.3.2 肿瘤复发与survivin表达(图1B)的相关性 将免疫组化结果判读分为两组，一组为阴性和弱阳，另一组为中阳和强阳，分为两组表达，进行分析，在95例患者复发与未复发比较中，发现survivin中-强表达的比率在复发组(24.4%)要低于无复发组(44.4%)，差异具有统计学意义(P=0.035，Fisher精确检验，表5)。在pT1期亦有同样的结果趋势，即在复发组无强阳性表达病例，而未复发组20.7%的肿瘤具有强表达(P=0.003，Fisher精确检验，表6)。

2.3.3 肿瘤复发与PTEN表达(图1C)的相关性 按两组表达结果进行分析，PTEN在复发组仅有1例为中+强表达(2.4%)，而在未复发组中16.7%为中+强表达，二者间具有统计学差异(P=0.024，Fisher精确检验，表5)。

2.3.4 肿瘤复发与p21、p27及p53表达(图1D～F)的相关性 喉癌术后复发组与未复发组肿瘤组织中的p21、p27及p53(有1例患者的切片中未检测到肿瘤)表达差异无统计学意义(P>0.05)(见表4～6)。

表4 免疫组化结果四级分组结果与肿瘤复发相关性分析

Table 4. Correlation between Immunohistochemical Results (4 Groups) and Tumor Recurrence in 95 Cases of Laryngeal Carcinoma

MarkersScores (4 groups)Recurrence (%)Nonrecurrence (%)Correlation, P p21011(26.8)13(24.1)0.221111(26.8)8(14.8)216(39.0)22(40.7)33(7.4)11(20.4)Total41(100)54(100)c-Myc02(4.9)2(3.8)0.016∗12(4.9)4(7.5)21(2.4)13(24.5)336(87.8)34(64.2)Total41(100)53(100)p53018(43.9)21(39.6)0.359∗15(12.2)2(3.8)24(9.8)5(9.4)314(34.1)25(47.2)Total41(100)53(100)p2707(17.1)11(20.4)0.902112(29.3)13(24.1)211(26.8)17(31.5)311(26.8)13(24.1)Total41(100)54(100)PTEN035(85.4)38(70.4)0.058∗15(12.2)7(13.0)208(14.8)31(2.4)1(1.9)Total41(100)54(100)Survivin012(29.3)6(11.1)0.072∗119(46.3)24(44.4)28(19.5)17(13.0)32(4.9)7(13)Total41(100)54(100)

*Fisher exact test.

表5 免疫组化结果两级分组结果与肿瘤复发相关性分析

Table 5. Correlation between Immunohistochemical Results (2 Groups) and Tumor Recurrence in 95 Cases of Laryngeal Carcinoma

MarkersScores (2 groups)Recurrence (%)Nonrecurrence (%)Correlation, Pp210+122(53.7)21(38.9)0.1102+319(46.3)33(61.1)Total41(100)54(100)c-Myc0+14(9.8)6(11.3)0.542∗2+337(90.2)47(88.7)Total41(100)53(100)p530+123(56.1)23(43.4)0.1552+318(43.9)30(56.6)Total41(100)53(100)p270+119(46.3)24(44.4)0.5092+322(53.7)30(55.6)Total41(100)54(100)PTEN0+140(97.6)45(83.3)0.024∗2+31(2.4)9(16.7)Total41(100)54(100)Survivin0+131(75.6)30(55.6)0.0352+310(24.4)24(44.4)Total41(100)54(100)

*Fisher exact test.

表6 T1期喉癌的免疫组化结果与肿瘤复发相关性分析

Table 6. Correlation between Immunohistochemical Results and Tumor Recurrence in T1 Laryngeal Carcinoma Patients

MarkersScores (4 groups)Recurrence (%)Nonrecurrence (%)Correlation, P∗p2107(31.8)7(24.1)0.65315(22.7)5(17.2)29(40.9)13(44.8)31(4.5)4(13.8)c-Myc02(9.1)2(6.9)0.04711(4.5)1(3.4)208(27.6)319(86.4)17(58.6)p53010(45.5)11(37.9)0.71012(9.1)1(3.4)22(9.1)2(6.9)38(36.4)15(51.7)Survivin06(27.3)00.003110(45.5)15(51.7)26(27.3)8(27.6)306(20.7)p2705(22.7)6(20.7)0.77217(31.8)9(31.0)25(22.7)10(34.5)35(22.7)4(13.8)pTEN017(77.3)26(89.7)0.06314(18.2)1(3.4)202(6.9)31(4.5)0

*Fisher exact test.

3 讨 论

喉癌或癌前病变术后或根治性放疗后复发并不少见，来自国家癌症中心和广东省人民医院的统计结果显示，喉鳞状细胞癌术后的复发率分别为20.2%[1]和23.4%[2]。而本组数据复发率约为9.5%，低于文献报道，这可能与入组病例为3年内复发病例和R0切除，以及与多学科诊治的开展、手术设备和技术的提升等有关。喉癌术后复发患者的疾病进展快、治疗效果欠佳，解决这一问题的关键环节是如何对术后复发提早预警。从临床角度分析，多篇文献显示手术切缘阳性、分化程度、临床分期及吸烟或饮酒的状态等与喉癌术后复发相关，与年龄、性别无显著相关[1-2]。本组复发患者均为男性，可能与喉癌有明显的男性倾向，并且男性中吸烟者和饮酒者的比例更高有关。本组结果亦提示，R0切除后肿瘤复发与肿瘤组织学分化程度存在相关性。

肿瘤分化程度与复发相关，分化越差，肿瘤复发率越高，这一结果在文献中亦有相同报道[1-3]。肿瘤分化差与预后不良有关，与高分化的患者相比，低分化者的3年存活率明显降低(45.1%vs88.5%)[4]。与喉癌预后相关的临床病理因素还包括浸润前沿肿瘤生长方式、血管神经侵犯、淋巴结转移、癌侵犯被膜外等[5]。

有研究发现，喉癌手术切缘组织中survivin阳性者的局部复发率明显高于阴性者(75.0%vs22.7%,P<0.05)[6]；本研究显示肿瘤组织survivin的强表达者复发率反而低。虽观察部位不同，但均显示survivin的表达与肿瘤的复发相关，提示该基因改变对肿瘤复发判断可能具有一定意义。有文献报道，survivin蛋白的高表达还与淋巴结转移、复发情况等临床病理特征有相关性，与预后呈负相关[7]。上述结果与survivin的作用机制相关。Survivin作为凋亡抑制因子对肿瘤的发生发展起一定作用，其主要通过抑制凋亡终末效应器caspase-3和caspase-7的活性或与周期蛋白激酶CDK4相互作用而阻断凋亡信号转导通路[8]。

c-Myc是一种包含亮氨酸拉链的转录因子，可以参与细胞转化、细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期调控[9]。本研究显示c-Myc的表达越强，肿瘤复发率越高。国内亦有无显著差异的研究报道[10]。c-Myc与肿瘤复发的相关性仍存争议。然而，对c-Myc的结构和功能的研究及靶点治疗为喉癌治疗提供了新希望[11-12]。

PTEN作为抑癌基因，在肿瘤细胞浸润、血管发生及肿瘤转移中起一定抑制作用[13]。我们的结果显示，喉癌肿瘤复发组与未复发组组织中PTEN的强表达情况存在差异(2.4%vs16.7%)，提示PTEN的强表达对肿瘤复发具有一定抑制作用(P=0.024)。另有研究对喉癌切缘组织行PTEN的检测，显示PTEN阳性者局部复发率明显低于阴性者(37.1%vs100.0%,P<0.05)[6]。PTEN在肿瘤组织和切缘组织的表达降低均显示与复发相关，提示可作为预测喉癌复发的分子指标。

野生型p53是重要的抑癌基因之一，突变型p53基因则发挥着原癌基因的作用，可促进肿瘤的发生、发展[14]，其蛋白半衰期长，可通过免疫组织化学方法检出[15]。在多数肿瘤中，可发现突变型p53蛋白的表达[16]。有研究显示喉癌手术切缘中p53蛋白阳性与术后局部复发明显相关[10]。p21与p27蛋白是细胞周期抑制蛋白，在细胞周期的调控中起重要作用[17-18]。p21基因存在p53依赖性和非依赖性两种途径，其表达与肿瘤预后关系的临床研究报道也不尽相同[19]，与喉癌复发相关性的报道也有争议[20-21]。p27蛋白表达在恶性肿瘤中的表达明显低于良性病变，其表达减少或缺失与患者的不良预后可能有一定关系[18,22]。而Korkmaz等[21]的研究结果显示，P27的高表达与早期喉癌复发有关。本研究中，上述蛋白的表达与喉癌或癌前病变术后复发无明显相关性(P>0.05)，说明上述基因蛋白表达在该领域还有待进一步研究，目前尚不能作为喉癌复发预警的标志物。

综上所述，影响喉癌或癌前病变术后复发是多因素的，本研究综合临床病理因素及热点肿瘤标志物的分析，提示c-Myc、survivin及PTEN的表达与肿瘤复发存在一定相关性，为患者的预后预警提供一定的帮助。

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