海南五指山猪TLR4基因克隆及生物信息学分析

黄丽丽　张艳　刘海隆　林哲敏　谭树义

摘要：为获得海南五指山猪TLR4基因序列并分析其分子结构特征，以GenBank中猪的TLR4基因序列为参考序列，采用PCR技术对该基因组序列进行克隆、测序及相关生物信息学分析。结果显示，获得的五指山猪TLR4基因DNA序列长10 435 bp，其中编码区全长2 526 bp，共编码841个氨基酸;与GenBank中发布的普通猪的TLR4基因序列相比，存在38处突变（其中有2处突变位于编码区）;与普通猪、牛、绵羊、犬、马、猕猴、人、黑猩猩、小鼠和鸡的同源性分别为99.9%、80.7%、79.9%、74.8%、74.7%、73.1%、73%、72.7%、62.5%、43.4%;五指山猪TLR4编码的蛋白属于分泌性蛋白和跨膜蛋白，具有亲水性，有8个糖基化修饰位点、17个丝氨酸（ser）、7个苏氨酸（Thr）及8个酪氨酸（TYR）磷酸化位点;氨基酸系统进化树分析表明，不同物种TLR4基因在进化过程中具有较高的保守性。该结果为进一步深入研究TLR4基因的功能奠定基础。

关键词：五指山猪;TLR4基因;克隆;生物信息学分析

中图分类号： S828.1;Q785文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）08-0041-05

Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）是一种模式识别受体，其可特异性地识别革兰氏阴性菌表达的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）或脂质A（LPS的活性成分），快速启动免疫反应，诱导各种炎性介质释放，激活相关免疫细胞来抵抗微生物的入侵，在动物机体的免疫反应和炎症等方面起重要作用[1]。目前，TLR4基因在免疫和感染领域研究较热。大量研究表明，TLR4基因的缺失或突变可能会诱发细胞对LPS的反应性减弱或丧失，导致机体对疾病易感性增加。如TLR4基因缺失会加重慢性阻塞性肺炎患者的肺损伤[2];近端肿瘤和转移性疾病的发生与TLR4基因的突变相关[3];TLR4基因突变会增加儿童患慢性肾盂肾炎的风险[4]。

海南五指山猪是重要的试验动物资源之一，也是国家试验用小型猪种质资源中心的首选猪种，社会、经济价值颇高。目前，尚未见到关于海南五指山猪TLR4基因克隆和相关功能结构预测的研究报道。因此，本研究于2016年6月以五指山猪为研究对象，利用克隆测序方法寻找五指山猪TLR4基因中的突变位点，并利用生物信息学软件对其序列进行分析和功能预测，为进一步研究五指山猪TLR4的功能及其基因遗传变异与免疫疾病的关系提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物与样本采集

选用10头海南省农业科学院畜牧兽医所永发猪场的五指山猪作为研究对象，[JP3]采集血液样品后，于-20 ℃保存于海南省农业科学院畜牧兽医所实验室备用。

1.1.2主要试剂

血液基因组DNA提取试剂盒、PCR产物纯化回收试剂盒、重组质粒抽提试剂盒，均购自天根生化科技（北京）有限公司;Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ、pMD18-T载体试剂盒，均购自宝生物工程（大连）有限公司;克隆宿主菌JM109，由海南省农业科学院畜牧兽医所实验室提供。

1.1.3引物设计与合成

根据GenBank中TLR4基因序列（登录号为AY753179.1）设计合成11对引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1DNA的提取

按照血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，取部分DNA样品稀释至100 ng/μL，-20 ℃保存备用。

1.2.2PCR扩增

PCR扩增体系为：DNA模板2.0 μL，10×PCR Buffer（不含Mg2+）2.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.0 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.0 μL，Ex Taq聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，P1（10 pmol/L）0.5 μL，P2（10 pmol/L）0.5 μL，無菌去离子H2O 15 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性4 min;94 ℃ 变性50 s，退火50 s（退火温度见表1），72 ℃延伸 2 min，30 个循环;最后72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3基因克隆及序列测定

利用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，将其连接到pMD18-T easy载体，再转化至JM109感受态细胞后，涂布含有IPTG、X-gal和氨苄青霉素的平板，37 ℃培养，挑取白斑接种于LB培养基中增菌培养后，经菌液PCR和酶切鉴定正确的送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.4生物信息学分析

利用DNAMAN软件对DNA序列进行比对拼接; 应用NCBI的ORF Finder程序寻找序列的开

放阅读框;利用MEGA（6.0）软件构建系统发育进化树;利用ProtParam（http：//web. expasy. org / protparam/）程序、Protscale软件、NetPhos 2.0 TMHMM程序、NetNGlyc（http：// www.cbs.dtu.dk/services/ NetPhos /）程序分析蛋白的特性，利用Signal P 4.1 Server 程序预测信号肽;利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/ TMHMM）软件预测跨膜结构域;利用SOPMA程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat. pl？ page =npsa_sopma. html）、SWISS-MODEL （http：//swissmodel.expasy.org/）分析蛋白的结构;通过PSORT I1程序进行亚细胞定位。

2结果与分析

2.1五指山猪TLR4基因的克隆

使用11对引物扩增五指山猪TLR4基因，分别获得长度为370、1 406、1 477、1 960、1 428、1 661、1 618、1 284、1 248、1 396、1 433 bp的DNA序列（图1）。

2.2五指山猪TLR4基因组序列分析

测序拼接后获得全长为10 435 bp的五指山猪TLR4基因DNA序列，其中CDS长2 526 bp，编码841个氨基酸（图2）。与GenBank发布的普通猪TLR4基因序列相比，存在38处突变（表2）;其中在CDS区序列存在2处突变，1处为无义突变，在7 779位点由G突变为A，不引起氨基酸变化;另1处为有义突变，7 781位点由G突变为A，氨基酸由精氨酸变为组氨酸。

2.3五指山猪TLR4氨基酸序列的同源性比对及系统进化树构建

由图3可知，五指山猪TLR4基因氨基酸序列同GenBank中已发布的普通猪（登录号AAW82895.1）、牛（登录号NP_776623.5）、绵羊（登录号NP_001129402.1）的氨基酸序列的同源性较高，分别为99.9%、80.7%、79.9%;与犬（登录号NP_001002950.2）、马（登录号NP_001093239.2）、猕猴（登录号NP_001032169.1）、人（登录号NP_003257.1）、黑猩猩（登录号BAG55036.1）、小鼠（登录号NP_067272.1）的同源性[CM（25]稍低，分别为74.8%、74.7%、73.1%、73%、72.7%、

62.5%;与鸡（登录号ACR26315.1）的同源性最低，为 43.4%。采用MEGA 6.0软件的NJ法系统构建进化树，结果（图3）显示，五指山猪TLR4基因与普通猪的亲缘关系最近，随后依次是绵羊、牛、犬、马、猕猴、人、黑猩猩、小鼠和鸡。

2.4五指山猪TLR4蛋白理化特性分析

经ProtParam软件在线预测显示，五指山猪TLR4蛋白分子量为96 312.93 u，等电点为6.12，分子式为 C4 378H6 808N1 146O1 241S30。其氨基酸组成及比例分别为：丙氨酸（Ala，4.4%）、精氨酸（Arg，3.4%）、天冬酰胺（Asn，6.7%）、天冬氨酸（Asp，4.6%） 、半胱氨酸（Cys，2.3%）、谷氨酰胺（Gln，5.2%）、谷氨酸（Glu，5.7%）、甘氨酸（Gly，3.7%）、组氨酸（His，3.9%）、異亮氨酸（Ile，5.6%）、亮氨酸（Leu，16.1%） 、赖氨酸（Lys，5.1%）、甲硫氨酸（Met，1.3%）、苯丙氨酸（Phe，6.7%）、脯氨酸（Pro，3.7%）、丝氨酸（Ser，8.6%）、苏氨酸（Thr，3.8%）、色氨酸（Trp，1.1%）、酪氨酸（Tyr，2.5%）、结氨酸（Val，5.7%）、吡咯赖氨酸（Pyl，0.0）、硒半胱氨酸（Sec，0.0）。SignalP-4.1软件预测发现，五指山猪TLR4蛋白有信号肽序列，说明其为分泌性蛋白（图5-A）。经Prot Scale软件分析发现，五指山猪TLR4蛋白841个氨基酸当中疏水性氨基酸最大值为2.811，亲水性氨基酸最小值为-2.867，大多数氨基酸为亲水性，属于亲水性蛋白（图5-B）。利用Tmhmm软件分析发现，五指山猪TLR4有1个跨膜区，属于跨膜蛋白（图5-C）。

2.5五指山猪TLR4蛋白结构预测

应用SOPMA程序预测五指山猪TLR4蛋白的二级结构发[CM（25]现，五指山猪TLR4蛋白主要由α-螺旋（47.44%）、延伸链（17.36%）、β-转角（8.44%）和无规则卷曲（26.75%）组成（图6）。利用SWISS-MODEL在线软件对五指山猪TLR4蛋白的三级结构预测后发现，TLR4蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲组成（图7），与二级结构预测结果相符。

2.6五指山猪TLR4蛋白亚细胞定位、磷酸化和糖基化位点预测及功能预测分析

定位分析发现，五指山猪TLR4蛋白在内质网、线粒体、膜泡分泌系统、细胞质、细胞外基质、质膜中均有分布，其比例分别为33.30%、22.20%、11.10%、11.10%、11.10%和 11.11%，其中在内质网中分布最多。磷酸化分析显示，五指山猪TLR4蛋白存在17个丝氨酸（ser）、7个苏氨酸（Thr）和8个酪氨酸（TYR）磷酸化位点。糖基化位点分析表明，五指山猪TLR4蛋白存在8个糖基化修饰位点，分别位于氨基酸序列的第35、第205、第238、第282、第309、第526、第575和第625位。

3讨论与结论

TLR4在天然免疫系统调节、炎症和组织损伤修复中发挥关键作用，不仅可以识别细菌脂多糖，还可被损伤诱发的内源性介质激活[5]。虽然大量研究都选择TLR4基因作为抗病的候选基因进行研究，但TLR4基因的变异与疾病的确切关系还不清楚。

本研究采用PCR法克隆了五指山猪的TLR4基因，序列分析结果显示，五指山猪TLR4基因DNA序列长10 435 bp，其中CDS长为2 526 bp，共编码841个氨基酸。与GenBank发布的普通猪TLR4基因序列相比，存在38处突变;其中在CDS区序列存在2处突变（1处为无义突变，另1处为有义突变，氨基酸由精氨酸变为组氨酸），说明五指山猪与普通猪TLR4基因的生物学功能可能存在一些差异。同源性分析结果显示，五指山猪TLR4基因氨基酸序列同普通猪、牛、绵羊、犬、马、猕猴、人、黑猩猩、小鼠和鸡的同源性分别为99.9%、80.7%、79.9%、74.8%、74.7%、73.1%、73.0%、72.7%、62.5%、43.4%，说明TLR4基因在不同物种间相对保守，但仍存在着一定的种属特异性。

蛋白质的功能与其空间结构有密切关系[6]。研究分析发现，五指山猪TLR4蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。其中α-螺旋是蛋白质中常见的、 含量也最丰富的二级结构原件，而无规则卷曲通常会构建成特性功能部位或是酶活性部位[7]。五指山猪TLR4蛋白有信号肽序列，说明其为分泌性蛋白;有1個跨膜区，说明其为跨膜蛋白，可能参与信号传导;蛋白中有许多亲水性氨基酸，因而该蛋白也具有亲水性。

磷酸化和糖基化是生物体蛋白质翻译后常见的修饰方式，广泛参与调节许多生命活动[8-9]，如干扰机体对抗原的应答反应，影响病毒的体外增殖[10]。对五指山猪TLR4蛋白进行磷酸化和糖基化位点分析后发现，五指山猪TLR4蛋白存在17个丝氨酸、7个苏氨酸和8个酪氨酸磷酸化位点，有8个糖基化修饰位点，但这些磷酸化和糖基化修饰位点对该基因的作用内容还须进一步深入研究。

参考文献：

[1]Zhou Y，Li Y B，Zhou B，et al. Inflammation and apoptosis：dual mediator role for toll-like receptor 4 in the development of necrotizing enterocolitis[J]. Inflammatory Bowel Diseases，2017，23（1）：44-56.

[2]Knobloch J，Chikosi S J，Yanik S，et al. A systemic defect in Toll-like receptor 4 signaling increases lipopolysaccharide-induced suppression of IL-2-dependent T-cell proliferation in COPD[J]. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology，2016，310（1）：L24-L39.

[3]Elliott D R，Perner J，Li X A，et al. Impact of mutations in Toll-like receptor pathway genes on esophageal carcinogenesis[J]. PLoS Genetics，2017，13（5）：e1006808.

[4]Harshman V P，Kryuchko T O，Kolenko I O，et al. Role of genetic mutations in development of immunological and clinical disorders in children with chronic pyelonephritis[J]. Wiadomosci Lekarskie，2017，70（1）：47-51.

[5]Mckeown-Longo P J，Higgins P J. Integration of canonical and noncanonical pathways in TLR4 signaling：complex regulation of the wound repair program[J]. Advances in Wound Care，2017，6（10）：320-329.

[6]王镜岩，朱圣庚，徐长法. 生物化学[M]. 北京：高等教育出版社，2002.

[7]丁咚，刘铮铸，李蕴玉，等. 罗斯308鸡IL-2基因的克隆及生物信息学分析[J]. 黑龙江畜牧兽医，2015，12（23）：90-94，314.

[8]周蕾，顾建新. N-糖基化位点鉴定方法和非经典N-糖基化序列[J]. 生命科学，2011，23（6）：605-611.

[9]阮班军，代鹏，王伟，等. 蛋白质翻译后修饰研究进展[J]. 中国细胞生物学学报，2014，36（7）：1027-1037.

[10]韦薇，项金忠，罗建辉. 真核细胞表达重组蛋白糖基化研究与评价[J]. 中国新药杂志，2014，23（15）：1743-1748.