工矿复垦区大豆根际微生物多样性对施肥制度的响应

张变华　靳东升　郜春花　郜雅静　李建华

摘要：选取山西省古交屯兰工矿复垦区为研究对象，设置4个施肥处理，即对照处理（CK）、无机肥处理（F）、有机肥处理（O）、有机无机配施处理（OF），将传统与现代微生物技术相结合，分析比较了工矿复垦区苗期大豆根际微生物多样性对施肥制度的响应。结果显示，传统微生物培养法表明不同施肥处理下大豆苗期根际微生物细菌、放线菌、真菌数量差异显著（P<0.05），细菌、放线菌数量由大到小顺序均为OF>O>F>CK，真菌数量由大到小顺序为O>F>OF>CK;Biolog-ECO分析发现香农-维纳指数由大到小顺序为OF>O>F>CK，均一度指数顺序为O>OF>F>CK，OF处理下大豆根际微生物多样性指数与CK处理差异显著，香农维纳指数由大到小顺序为OF>O>CK>F，OF处理下大豆根际微生物活性高，代谢功能强;16S rDNA分析表明，OF处理下大豆根际微生变形菌门（Proteobacteria）丰度最高，且与O处理大豆根际微生物具有相似亲缘性属，而CK处理下大豆根际微生物绿弯菌门（Chloroflexi）与酸杆菌门（Acidobacteria）丰度最高，与F处理下大豆根际微生物具有相似亲缘性属。总体来看，大豆根际微生物多样性对施肥的响应变化明显，OF处理与CK对照处理差异显著。

关键词：工矿复垦区;根际微生物多样性;大豆;施肥

中图分类号： S154.3文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）08-0248-04

土壤微生物参与土壤有机质分解、养分转化与循环等多种生化过程，是评价土壤质量优劣的重要指标[1]。而工矿复垦区内土壤有机质含量低，团聚体少，微生物活性差，提高矿区复垦土壤质量可以缓解我国人均耕地少、质量差的现状，保持农业可持续发展。根际是连接植物、土壤和微生物的纽带，根际微生物繁殖速度较快、数量庞大、代谢旺盛，在土壤有机质的转化、提供植物养料、维持土壤肥力等方面都具有重要作用[2-4]。当前已有许多研究表明，豆科植物是改良土壤质量的先锋物种，对于生态重建有重要意义[5-7];在植物根际土壤理化性质、微生物多样性、土壤酶活性等方面[8-10]已有许多研究，但是在工矿复垦区开展植物根际微生物评价研究较少[11-16]，对于山西工矿复垦区豆科植物根际生物学性质的相关研究更少。山西作为煤炭大省，复垦面积广;因此，本试验将山西省古交屯兰矿区复垦地作为试验区，利用传统微生物培养法、Biolog-ECO和16S rDNA相结合的方法，从微生物种类、数量、代谢功能等多样性的视角分析评价工矿复垦区大豆根际微生物对施肥制度的响应特征，研究豆科植物种植下根际土壤微生物多样性特点，旨在为今后矿区复垦与生态重建技术研究提供理论依据。

1材料与方法

1.1研究区概况

试验区位于山西省古交屯兰工矿复垦区，该区于2014年复垦为农田，目前仍处于复垦初期，年均气温约9.5 ℃，年均降水量约460 mm，2017年种植豆科植物大豆。本试验设置4个施肥处理：对照处理（CK）、无机肥处理（F）、有机肥处理（O）、有机无机配施处理（OF）。CK处理施肥量为0，其他处理按照等氮量施肥150 kg/hm2，无机肥为复合肥，其中氮、五氧化二磷、氧化钾质量比（N ∶P2O5 ∶K2O）为=18 ∶12 ∶10，有机肥施用平遥国青（由平遥县国青同盈禽业有限公司生产，有机质含量53.48%，含氮2.2%），OF处理施肥量为1/2有机肥加1/2无机肥。

1.2根际土壤取样

于2017年6月9日在大豆生长季苗期，划定小区2 m×2 m，采用抖落法[17]在不同施肥处理下选择大小相似的大豆8～10株，每个处理3次重复。用毛刷轻轻地刷下0～5 mm 的根际土，将其收集在无菌塑料袋中，然后放入装有冰袋的保温箱内带回实验室进行室内分析化验。

1.3试验方法

1.3.1传统微生物培养根际土壤细菌、放线菌、真菌分别采用牛肉膏蛋白胨培养基、高氏改良培养基、孟加拉红培养基进行培养。

1.3.2Biolog-ECO称取10 g根际土壤，放入灭菌的装有90 mL浓度为0.85% NaCl的带玻璃珠的三角瓶中，然后以250 r/min在摇床上充分震荡30 min，10倍稀释2次后，吸取稀释后的150 μL土壤溶液加入到Biolog-ECO的96个孔中，然后放入培养箱28 ℃恒温培养，利用Biolog分析仪每隔24 h读取各孔的吸光度，连续测7 d。

1.3.316S rDNA高通量测序由上海派森诺生物公司对植物根际进行微生物组DNA提取，包括目标片段PCR扩增、产物回收纯化、荧光定量等，使用MiSeq测序仪测定大豆根际微生物V3-V4区的操作分类单元（operational taxonomic units，简称OTU）。

1.4统计分析

利用Excel、SPSS、R软件对所测数据进行方差与聚类分析。

2结果与分析

2.1工矿复垦区大豆根际微生物数量对施肥制度的响应特征

从图1可以看出，不同施肥处理下，工矿复垦区大豆根际细菌数量差异显著，从大到小顺序为OF>O>F>CK;其中，OF处理下大豆根际细菌数量最多，显著高于其他处理;说明施肥利于工矿复垦区大豆根际微生物细菌数量的增加，且配施有机无机的处理对增加根际细菌数量的效果最好。

从图2可以看出，不同施肥处理下大豆根际放线菌数量差异显著，从大到小顺序为OF>O>F>CK;其中，OF处理下大豆根际放线菌数量最多，显著高于其他处理;说明施肥利于工矿复垦区大豆根际微生物放线菌数量的增加，且OF处理下放线菌数量最多。

從图3可以看出，不同施肥处理下大豆根际真菌数量差异显著，由大到小顺序为O>F>OF>CK;其中，O处理下大豆根际真菌数量最多，显著高于其他处理，说明施肥可以增加工矿复垦区大豆根际微生物真菌数量，且与CK相比，单施有机肥处理的真菌增量最大，而OF处理下增量最小。

2.2不同施肥处理下工矿复垦区大豆根际土壤平均颜色变化率动态变化

从图4可以看出，大豆苗期根际土壤平均颜色变化率（average well color development，简称AWCD）吸光度随培养时间的延长而增长，96 h后增长缓慢变化。在0～24 h内，大豆根际土壤AWCD吸光度基本上无明显变化;在24～48 h内，大豆根际土壤吸光度迅速增加，其中，F处理下大豆根际土壤AWCD值最大;随后在48～168 h时，大豆根际土壤AWCD吸光度的大小顺序均为OF>F>O>CK;说明大豆根际土壤微生物活性影响对施肥的响应较强，施肥可以增加苗期大豆根际土壤碳的吸收率，且有机无机配施下大豆根际微生物活性最大，利用碳源的能力最强。

2.3工矿复垦区大豆根际微生物多样性指数对施肥制度的响应特征

土壤微生物群落功能多样性表征土壤生态系统中微生物群落对土壤中碳源类型利用多少的能力，本试验采用的微生物多样性指数为土壤微生物群落的香农-维纳指数（H'）和Mclntosh均一度指数（U）[18]，计算公式见表1。

本试验利用96 h的AWCD数据来分析计算工矿复垦区苗期大豆根际微生物多样性指数，由表2可知，施肥对工矿复垦区大豆根际土壤微生物群落香农-维纳指数、均一度指数有影响，CK处理下大豆根际微生物香农-维纳指数和均一度指数最低，但是CK和F处理间差异均不显著，而CK与OF处理差异均显著（P<0.05），且OF处理下大豆根际微生物香农-维纳指数最高。说明施肥处理有利于苗期大豆根际微生物香农-维纳指数和均一度指数增加，使微生物活性提高，微生物代谢功能增强。总体来看，OF处理对于提高大豆苗期根际土壤碳源利用的效果较好。

2.4工矿复垦区大豆根际土壤微生物类别对施肥制度的响应特征

从图5可以看出，不同施肥处理下工矿复垦区苗期大豆根际微生物丰度值大于5%的门有放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、蓝菌门（Cyanobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria），OF处理下放线菌门、蓝菌门的丰度最低，变形菌门丰度最高，CK处理下绿弯菌门与酸杆菌门的丰度最高。

从图6可以看出，工矿复垦区苗期大豆根际微生物属对施肥制度的响应明显。根据大豆根际微生物属的相对丰度可以将其分为2类，CK与F具有相似亲缘性，主要表现在丰度值较高的诺卡氏属（Nocardoides）与土壤红杆菌属（Solirubrobacter）;O与OF具有相似亲缘性，主要表现在丰度值较高的中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）、德沃斯氏菌属（Devosia）、糖霉菌属（Glycomyces）、Ohtaekwangia和壤霉菌属（Agromyces）。

3结论与讨论

大豆根际土壤微生物数量对施肥制度响应明显。本试验发现，不同施肥处理下工矿复垦区苗期大豆根际细菌、放线菌、真菌数量均存在显著性差异;其中，施肥处理的大豆根际微生物数量均显著高于CK处理，且有机无机配施（OF）处理下大豆根际细菌、放线菌数量与CK处理相比数量差异最大。这与芦思佳等的研究结果[19-21]一致。

施肥可以增加土壤有机质的含量，为微生物提供碳源与能量，进而提高土壤微生物活性，促进土壤微生物功能代谢[20]。本试验发现，工矿复垦区苗期大豆根际土壤微生物AWCD随时间的推移呈动态增加，有机无机配施处理下AWCD和微生物多样性香农-维纳指数最高，而CK处理下大豆根际微生物的AWCD与香农-维纳指数最低，说明大豆根际微生物对有机无机配施处理响应强烈，原因可能是有机无机配施可以为根际微生物提供充足的碳源，提高微生物新陈代谢功能，因此对于改善山西工矿复垦区土壤微生物活性差、有机质含量低的特征效果最佳。

工矿复垦区苗期大豆根际微生物优势属在施肥处理间存在差异，且有机肥、有机无机配施下土壤微生物属具有相似亲缘性，而无机肥、对照处理下微生物属具有相似亲缘性。

土壤微生物是土壤生态系统变化的敏感性指标，可以表征土壤生态系统的质量和健康状况[22-23]。传统微生物培养适用于测定具有特殊生理功能的微生物，但当微生物种类较多时，无法培养，难以测定[24]。Biolog法可获取微生物群落总体活性与代谢功能信息[25]，16S rDNA通过提取微生物组总DNA可鉴定微生物菌群结构[26]。本试验利用传统与现代微生物研究方法的优势特点对工矿复垦区苗期大豆根际土壤微生物多样性进行了研究，试验结果得出，有机无机配施下大豆对改善土壤微生物活性效果最佳，并发现了其中丰度较高的优势属，但是大豆根系分泌物可能会因气温、降水等环境改变而变化，不同施肥处理下大豆根际微生物的优势属在快速生长期与衰退期可能会发生差异，因此有待后续进一步研究。

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