铵硝混合营养对烟草苗期氮代谢酶及内源生长素的影响

宋文静　宋科　董建新　李永亮　况帅　禚其翠　李帅　梁洪波

摘要：为探究不同硝响应型烟草品种氮素代谢关键酶活性对不同铵硝配比的响应，以硝响应度强的烟草品种NC89和硝响应度弱的烟草品种中烟100为供试材料，在控制条件下进行水培处理，研究3种铵硝配比对2个品种烟株生物量积累和氮素吸收的影响，以及氮素同化过程中相关酶活性和内源生长素含量对不同硝铵配比的响应。结果表明，铵硝比50/50处理可显著促进不同硝响应型烟草品种生物量的增加和氮素积累;硝响应度强烟草品种NC89低硝处理地上部硝酸还原酶（NR）活性显著高于铵硝比50/50处理，而根系中的差异则相反，硝响应度弱烟草品种中烟100不同处理下NR活性无显著差异;中烟100和NC89烟株体内谷氨酰胺合成酶（GS）活性整体随铵态氮比例的增加而提高;中烟100和NC89根系中谷氨酸脱氢酶（GDH）活性均以全硝处理最低，中烟100较NC89具有更高的GDH活性来缓解高浓度NH4+;中烟100和NC89地上部和根系的生长素含量均表现为最佳铵硝比50/50处理>全硝处理>低硝处理，中烟100全硝处理和低硝处理根系生长素含量较铵硝比50/50处理的降幅与地上部基本一致，而硝响应度强烟草品种NC89全硝处理和低硝处理根系中生长素含量较铵硝比50/50处理的降幅远大于其地上部。由此推论，不同铵硝营养下，不同硝响应型烟草品种氮代谢酶及内源生长素存在响应差异。

关键词：铵硝配比;烟草;氮代谢酶活性;内源生长素

中图分类号： S572.06文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）08-0100-05

如何提高烟叶品质是烤烟生产上的关键问题，烟叶的烟碱含量和吸食生理强度与烟叶中的氮素含量有关，而烟叶中的氮素含量不仅受土壤中氮素供应量的影响，且取决于烟株对氮素的吸收利用效率。烤烟是喜硝作物，但适当增铵却能促进烤烟的干物质积累和根系发生与伸长，这可能与不同铵硝营养引起植株体内氮代谢相关酶活性发生变化有关。硝酸还原酶（NR）是NO3-进行同化过程的关键酶。谷氨酰胺合成酶（GS）是将无机态氮催化合成为有机态氮的关键酶[1-2]，根系直接吸收NO3-在NR的作用下还原成NO2-，NO2-在质体中被亚硝酸还原酶（NiR）还原成NH3，形成的NH3在GS的作用下形成氨基酸，该过程需要消耗大量糖类来提供碳架。李彩凤等研究发现，不同氮素形态处理的甜菜体内氮同化相关酶活性不同，其中硝酸还原酶活性随硝态氮比例的增大而升高[2]，郝敬虹等[3]也得到相似的试验结果。Song等研究发现，与单一NO3-营养相比，在铵营养增加时，水稻苗期根系NR活性提高[4-5]，而铵硝营养处理对水稻苗期地上部NR活性的影响与根系一致[6-7]。Magalhes等研究指出，单一铵态氮源处理时，玉米植株中的GS活性随着NH4+浓度的升高而增大，且地上部高于地下部[8]。张宏纪等研究表明，在同一施氮水平下，GS活性随铵硝比例的增大而增大[9]。刘卫群等研究发现，单纯对烤烟施铵态氮的处理，烟株体内NR、GS活性较高[10]。谷氨酸脱氢酶（GDH）作为参与植物同化氮素的主要酶之一，在植物氮代谢中起着重要作用。现有研究推测，GDH可能能够有效缓解植物的铵毒害作用[11]。在不同植物中，GDH对外界NH4+有不同的反应浓度，因此不同植物能够适应的NH4+浓度不同，这可能与GDH自身结构上的差异以及在不同植物体中产生的同工酶有关[12]。

生长素（IAA）是植物体最重要的内源激素，对植物根系的生长发育具有重要作用。王波等对生菜的研究发现，铵硝混合营养处理比单一硝营养处理的IAA含量高[13]。郭红祥等通过水培试验发现，不同氮素形态处理的烟苗IAA含量达到显著差异水平[14]。说明植物内源生长素含量对不同铵硝营养的响应不同。

目前关于不同硝响应型烟草品种氮代谢关键酶对不同铵硝配比的响应差异研究较少，因此本试验采用水培方法，研究中烟100和NC89在不同铵硝配比下氮代谢关键酶活性和内源生长素含量的差异，以期通过氮代谢途径关键酶活性探明烤烟对不同铵硝配比的响应机制。

1材料与方法

1.1试验地概况

试验于2016年在中国农业科学院烟草研究所试验场温室进行。

1.2供试材料

NC89是美国1976年杂交育成的品种，中烟100是中国烟草遗传育种研究（北方）中心选育的优质多抗烤烟新品种，均是国内主栽品种。

1.3试验设计

将消毒后的NC89和中烟100裸种分别播种于塑料培养盒中，待幼苗出土25 d后，選取长势一致的烟苗，用清水洗净根部基质，用海绵包裹烟苗根茎结合处并固定在Karat board（KT板）上，转移至装有15 L清水的塑料圆盆式周转箱中培养3 d，每个圆盆式周转箱（pot）培养3株烟苗，缓苗后再用不含氮素的霍格兰营养液培养2 d，然后进行不同铵硝配比处理。改良后的霍格兰营养液成分为：N 3.75 mmol/L、P 0.25 mmol/L、K 2.00 mmol/L、Mg 0.25 mmol/L、Ca 3.75 mmol/L、Fe（Fe-EDTA）20.00 μmol/L、Mn 9.00 μmol/L、B 46.00 μmol/L、Zn 0.80 μmol/L、Cu 0.30 μmol/L、Mo 0.50 μmol/L。

对NC89和中烟100设置3个铵硝配比处理，分别为NO3--N 3.75 mmol/L（NH4+/NO3-=0/100，全硝处理）;NH4+-N和NO3--N各1.875 mmol/L（NH4+/NO3-=50/50，最佳铵硝比处理）;NH4+-N 3.65 mmol/L，NO3--N 0.10 mmol/L（NH4+/NO3-=97/3，低硝处理）。其中N以NaNO3、KNO3、（NH4）2SO4和NH4NO3的形式加入。营养液每2 d更换1次，并用0.1 mol/L的HCl将pH值调至6.0。自烟苗处理当天起，第7天取样进行测定。

1.4测定内容与方法

1.4.1生物量和氮含量测定

将烟株样品分部位置于80 ℃烘箱48 h，然后用千分之一天平分别称其质量并记录。总氮含量参照YC/T 33—1996《烟草及烟草制品 总氮的测定 克达尔法》，采用全自动凯氏定氮仪进行测定。

1.4.2氮代谢酶含量测定

NR活性参照李合生的方法[15]测定。GS活性参照段英华等的方法[16]测定。GDH活性参照Groat等的方法[17]测定。

1.4.3生长素浓度测定

采用酶联免疫法测定IAA浓度。

1.5数据分析

采用Excel 2007软件进行数据整理和作图，采用SAS 9.3数据分析软件进行统计分析。

2结果与分析

2.1铵硝混合营养对烟草苗期生物量的影响

由表1可知，处理后第7天，最佳铵硝比处理中烟100和NC89的地上部和根系干质量均显著大于低硝处理，硝响应度弱烟草品种中烟100全硝处理与低硝处理无显著差异，而NC89 3个处理间均达到显著差异水平。说明与全硝、低硝营养条件相比，最佳铵硝比更能促进烟苗地上部和根系干物质的积累。另外，与硝响应度弱烟草品种中烟100相比，硝响应度强烟草品种NC89处理间差异更大，说明NC89对铵硝营养更加敏感。

2.2铵硝混合营养对烟草苗期氮积累量的影响

由图1可知，处理第7天，不同处理中烟100、NC89的氮积累量存在差异，2个品种最佳铵硝比处理的氮含量均显著高于其他处理。不同硝响应度烟草品种氮素积累量趋势一致，均为最佳铵硝比处理显著大于全硝、低硝处理，且全硝处理和低硝处理无显著差异。说明最佳铵硝比营养条件能够有效促进烟苗对氮素的吸收利用。

2.3铵硝混合营养对烟草苗期NR活性的影响

从图2可以看出，在不同铵硝配比下，硝响应度弱烟草品种中烟100地上部和根系NR活性无显著差异，说明在不同铵硝营养环境中，中烟100始终保持较为稳定的硝同化能力。硝[CM（25]响应度强烟草品种NC89地上部与根系NR活性变化趋势不一致，由于大部分NO3-在根系中被还原，因此根系中的NR活性更能代表幼苗的硝态氮同化能力，与低硝处理相比，全硝处理和铵硝比50/50处理可促进根系NR活性的提高，其中铵硝比50/50处理的促进效果达到显著水平，这与Alexander等的研究结果[5]一致。

2.4铵硝混合营养对烟草苗期GS活性的影响

由图3可知，中烟100和NC89的GS活性整体随着NH4+浓度的升高而增大，这与刘卫群等的研究结果[10]一致;且2个品种全硝处理与低硝处理地上部和根系中的GS活性差异均达到显著水平。与硝响应度弱烟草品种中烟100相比，硝响应度强烟草品种NC89处理间差异更大，3个处理间地上部和根系中的GS活性均达到显著差异水平。说明在不同铵硝配比条件下，不同烟草品种的GS活性产生的响应程度不同。

2.5铵硝混合营养对烟草苗期GDH活性的影响

根据吴颂如等的研究[12]，不同植物能够适应的NH4+浓度不同，这可能与GDH自身结构上的差异以及在不同植物体中产生的同工酶有关。笔者所在实验室在前期试验中发现，烤烟品种NC89对不同铵硝配比有不同的响应[18]，因此猜测，不同硝响应型烟草品种的GDH活性对相同NH4+浓度有不同的响应。由图4可知，不同硝响应度烟草品种地上部GDH活性均无显著差异，根系中的GDH活性均以全硝处理最低，这可能是由于大部分NH4+在根系中累积，引起根系中的GDH活性变化。在全硝处理、铵硝比50/50处理和低硝处理下，硝响应度弱烟草品种中烟100根系GDH活性分别比NC89高171.4%、91.3%和42.9%，因此中烟100具有更高的GDH活性来缓解高浓度NH4+胁迫。

2.6铵硝混合营养对烟草苗期内源生长素的影响

从图5可看出，不同硝响应度烟草品种地上部和根系生长素含量均表现为铵硝比50/50处理>全硝处理>低硝处理。与铵硝比50/50处理相比，中烟100全硝处理地上部和根系生长素含量分别降低13.3%和12.0%，中烟100低硝处理地上部和根系生长素含量分别降低27.1%和32.8%。与NC89铵硝比50/50处理相比，NC89全硝处理在地上部和根系生长素含量分别降低9.1%和40.0%，NC89低硝处理在地上部和根系生长素含量分别降低21.0%和 62.5%。与铵硝比50/50处理相比，全硝、低硝处理的烟草品种中烟100地上部与根系中生长素含量的降幅基本相当，而硝响应度强烟草品种NC89根系中生长素含量的降幅远大于其地上部，说明NC89全硝、低硝处理均影响其生长素由地上部向根系运输。

3结论与讨论

饶学明研究认为，铵硝比为50/50时烤烟根系干物质积累量显著增加[19]。本研究结果显示，不同硝响应度烟草品种全硝、低硝处理地上部和根系氮积累量均显著低于铵硝比50/50处理，说明铵硝比50/50处理可显著促进氮素的积累。NR是植物体内一种重要的氮代谢酶，外源供应氮素形态影响其活性，并且作物种类不同其变化趋势也不同。由于大部分NO3-在根系中被还原，因此根系中的NR活性更能代表硝态氮的同化能力。本研究表明，硝响应度强烟草品种NC89地上部与根系NR活性随铵硝比的变化趋势不一致，其中铵硝比50/50处理根系中NR活性显著高于低硝处理;不同处理间硝响应度弱烟草品种中烟100地上部和根系的NR活性没有呈现出显著差异。因此不同硝浓度条件下，硝响应度强烟草品种NC89根系中的NR活性能产生更大幅度变化。

GS对NH4+有着高度的亲和性，可以催化低浓度的NH4+同化。本研究发现，2个品种低硝处理地上部和根系GS活性都显著高于全硝处理，且GS活性整体随着铵硝比的增加而增加，但地上部低硝处理比铵硝比50/50处理的增幅水平小于铵硝比50/50处理比全硝处理的增幅。这可能存在3个方面的原因，（1）NH4+经GS催化合成的谷氨酰胺对GS具有负反馈作用，谷氨酰胺含量达到一定程度时能够下调GS活性;（2）低硝处理下NH4+作為底物，浓度趋于饱和时，单位时间内同化NH4+的增速减慢;（3）在同化NH4+的过程中，会产生H+，使细胞内pH值下降，进而抑制GS活性。另外，与全硝处理相比，硝响应度强烟草品种NC89低硝处理GS活性增幅明显大于中烟100;在全硝处理下，NC89地上部GS活性明显低于中烟100。可见GS活性因品种硝响应度的不同而有很大差异。在后续研究中，可通过测定GS相关基因的表达来进一步探究烟草GS活性对不同铵硝配比的响应机制。

GDH作为氮素代谢过程中的一个关键酶，它能够催化合成或分解谷氨酸。汪健飞研究表明，GDH的主要功能在于分解谷氨酸[20]。相关研究发现，GDH能够促进大豆吸收利用铵态氮[21]。本研究结果表明，中烟100和NC89不同处理下地上部GDH活性没有显著差异，与全硝处理相比，铵硝比50/50处理根系中GDH活性具有较大幅度的提高。说明外源NH4+能够有效诱导GDH活性的提高，且在NH4+浓度较高时，GDH活性的提高有利于降低NH4+在植物体内的浓度。与中烟100相比，硝响应度强烟草品种NC89各处理GDH活性较低，这可能是其在不同硝营养下响应强烈的原因之一。

宋文静研究发现，与全NH4+营养相比，增NO3-营养处理显著增加了水稻地上部、韧皮部以及根系中的生长素含量[22]，说明增硝营养促进了生长素的合成以及向根系的极性运输。卢颖林在研究番茄增硝营养时发现，随着营养液中NH4+的增加，番茄木质部伤流液中的细胞分裂素（CTK）和IAA总累计量显著降低[23]。以上研究结果说明，植物内源生长素对不同铵硝营养存在不同响应。在本试验中，与铵硝比50/50处理相比，不同硝响应度烟草品种全硝处理和低硝处理根系生长素含量均有所下降，其中低硝处理地上部和根系中的降幅均达到显著水平。在2品种之间，NC89全硝、低硝处理根系中生长素含量降幅较大。由于生长素外输载体（PIN）家族在根系生长素极性运输过程中起到重要作用，因此在后续研究中，可对PIN家族基因进行PCR分析，研究其表达差异，明确在不同铵硝营养下烟草内源生长素存在响应差异且品种间存在响应差异的机制。

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