泛素基因沉默对TLR4/NF-κB信号通路中关键分子表达的影响

刘超英　董骎　高洪　严玉霖　富国文　单春兰

摘要：为了探讨泛素（ubiquitin，简称Ub）对TLR4/NF-κB信号通路中关键分子表达的影响，通过脂质体将短发夹RNA（shRNA）质粒转染猪小肠上皮细胞，使其泛素基因沉默，于转染后6、12、24、48 h收集细胞及其上清。应用荧光定量PCR检测细胞内TLR4/NF-κB信号通路中关键分子TLR4、NF-κB、MyD88、IκB-α的mRNA表达水平，应用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测NF-κB、IκB-α及炎性因子TNF-α、IL-1含量的变化。结果显示，shRNA质粒有效地抑制了泛素基因的表达，转染shRNA质粒后，TLR4/NF-κB信号通路中TLR4、NF-κB、MyD88和IκB-α的mRNA表达量及NF-κB、IκB-α、TNF-α和IL-1含量均普遍呈下降的趋势，说明泛素在炎性因子的释放中起着至关重要的作用，泛素基因的沉默能够抑制该通路的活化。

关键词：泛素;基因沉默;信号通路;炎性因子

中图分类号： S188文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）08-0037-04

泛素-蛋白酶体途径是一种广泛存在于真核细胞中的非常重要的、依赖于腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的蛋白质降解途径，可以从多个环节参与调控NF-κB信号通路[1-3]。泛素（ubiquitin，简称Ub）作为该途径的重要组成部分，可以降解TLR4/NF-κB信号通路中的IκB，使NF-κB游离到细胞核内参与炎性因子的合成，从而诱发炎症反应[4-6]。当该途径受到抑制时，会导致活性NF-κB的产生量减少，抗凋亡蛋白的水平随之降低，使细胞出现凋亡[7]。

短发夹RNA（short hairpin RNAs，简称shRNAs）是能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，因其具有特殊的茎环结构，在哺乳动物细胞中可以长期甚至稳定地发挥RNA干扰作用，而不引起非特异性反应。因此，目前shRNA介导的RNA干扰技术已经成为研究哺乳动物细胞内外基因功能强有力的工具[8-10]。为了研究泛素基因对TLR4/NF-κB信号通路的作用，本研究利用shRNA干扰技术对猪小肠上皮细胞的泛素基因进行沉默，并对TLR4/NF-κB信号通路中关键分子的表达情况进行检测，不仅可以为基因沉默的相关研究提供理论依据，还可以为从蛋白降解角度寻找治疗炎症类疾病的新思路奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

猪小肠上皮细胞（IPEC-J2），购自广州吉尼欧生物有限公司;焦碳酸二乙酯（DEPC）、2×Easy Taq PCR Super Mix，购自北京百泰克生物有限公司;Lipofectamine 3000转染试剂，购自Lifetechnologies公司;胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶溶液[025% 胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）]，购自Gibico公司;DMEM高糖培养基，购自Hyclone公司。本试验于云南农业大学动物医学院动物病理实验室完成。

1.2试验方法

1.2.1猪小肠上皮细胞的培养于37 ℃水浴，使IPEC-J2尽量在1 min内完全融化，于4 000 r/min离心5 min，加入 1 mL DMEM培養液将底部细胞吹打均匀后，注入含有6 mL DMEM培养液和10%胎牛血清的细胞培养瓶内，轻缓摇晃使细胞均匀分布，然后置于37 ℃、5% CO2的温箱内培养。

1.2.2shRNA质粒的设计及构建根据美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站中的猪泛素基因的核苷酸序列，设计针对猪泛素基因保守区的shRNA序列UBC-sus-263（5′-GAGAACGTCAAGGCGAAGATC-3′），并设计阴性对照 UBC-shNC（5′-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3′），质粒载体为U6/GFP/Neo，带绿色荧光标记，由上海吉玛制药公司合成。将质粒DNA溶液于-20 ℃保存，对应的甘油菌液于 -80 ℃ 保存。

1.2.3泛素基因沉默在六孔板中培养IPEC-J2细胞，当汇合度达到80%左右时将培养液换为2 mL无血清、无抗生素的DMEM培养基，开始转染。转染分为空白细胞对照组、shRNA质粒转染组和空白质粒转染组，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，分别在培养6、12、24、48 h时收集细胞及其上清。

1.2.4引物设计本试验选用β-actin作为内参基因，在NCBI网站中查找公开发表的β-actin、TLR4、NF-κB、MyD88和IκB-α基因序列，遵循实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）的引物设计原则，利用Primer 6.0软件设计引物，并由深圳华大基因股份有限公司合成，引物序列如表1所示。

1.2.5Real-Time PCR提取细胞总RNA，然后按照反转录说明书于冰上配制反应液，反转录结束后按下列组分配制荧光定量PCR反应液：12.5 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RnaseH Plus）（2×），各0.7 μL PCR上下游引物（10 μmol/L），2.0 μL模板，9.1 μL dH2O，将上述反应液加入0.2 mL八联排管中混匀，离心，在Bio-Rad Real-Time PCR仪上进行反应，反应程序设置如下：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，Tm 20 s，72 ℃ 30 s，40个循环;溶解曲线55 ℃ 30 s，81个循环。结束后保存数据，并计算各指标的mRNA相对表达量。

1.2.6酶联免疫吸附试验（ELISA）检测采集不同时期各处理组的细胞培养上清液，用ELISA试剂盒检测IκB-α、NF-κB 及炎性因子 IL-1、TNF-α的含量。

1.2.7数据处理本试验中的所有数据均用SPSS 16.0进行统计分析，试验结果以平均值±标准差（x[TX-*5]±s）表示，用单因素方差分析比较各组均值的差异显著性。

2结果与分析

2.1转染shRNA质粒后IPEC-J2细胞中泛素基因的表达情况

根据24、48 h的反应循环数（CT值），计算shRNA质粒转染IPEC-J2细胞后Ub基因的mRNA相对表达量。如图1所示，UBC-sus-263的shRNA质粒对泛素基因的沉默效果较好，在2个时间点中，其表达量均仅为空白细胞组的2%，表现出极显著差异（P<0.01）。

2.2IPEC-J2细胞中TLR4、NF-κB、IκB-α 及MyD88的mRNA表达量

由图2-A可以看出，shRNA质粒转染IPEC-J2后，细胞内的TLR4表达量明显降低，相较于对照组显示出极显著差异，在24 h时降至最低值。而空白质粒组转染后细胞内的TLR4表达量较空白细胞组略微升高，6 h时差异极显著，24 h时差异显著，其他时间点差异不明显。由图2-B可以看出，shRNA质粒表达载体转染IPEC-J2后，细胞内的 NF-κB 表达量明显降低，相较于对照组表现出极显著差异，在12 h时降至最低值。而空白质粒组转染后细胞内的NF-κB表達量较空白细胞组升高，在6 h时与对照组相比差异显著，12、48 h与空白对照组相比表现出极显著差异。由图2-C可以看出，shRNA质粒转染IPEC-J2后，细胞内的IκB-α表达量明显降低，相较于对照组表现出极显著差异，在24 h时降至最低值。而空白质粒组转染后细胞内的IκB-α表达量较空白细胞组呈上升趋势，12、24 h时与空白对照组差异显著，48 h 时差异极显著。由图2-D可以看出，shRNA质粒转染IPEC-J2后，细胞内的MyD88表达量明显降低，相较于对照组显示出极显著差异，在48 h时降至最低值。而空白质粒组在6、48 h时细胞内的MyD88表达量较空白细胞组略微升高，而12、24 h时的表达量略微降低，与空白对照组间差异不显著。

2.3IPEC-J2细胞中细胞因子的ELISA检测结果

由图3-A可以看出，在各时间点，shRNA质粒转染组细胞中的NF-κB含量明显低于空白细胞组、空白质粒转染组，6 h时与空白组间差异极显著，其余时间均显示出显著差异。由图3-B可以看出，在转染12～48 h，shRNA质粒转染组细胞中的IκB-α含量明显低于空白细胞组、空白质粒转染组，并在12、48 h时与空白对照间显示出显著差异，24 h时差异极显著。由图3-C可以看出，在各时间点，shRNA质粒转染组细胞中的TNF-α含量明显低于空白细胞组、空白质粒转染组，并在6、24、48 h时与空白对照组间显示出极显著差异，12 h时差异显著。由图3-D可以看出，在各时间点，shRNA质粒转染组细胞中的IL-1含量明显低于空白细胞组、空白质粒转染组，并在24、48 h时与对照组显示出极显著差异，在6、12 h时与空白对照组间差异显著。

3讨论

在TLR4/NF-κB信号通路中，泛素扮演着重要的角色，研究认为，很多泛素化抑制因子可以作为治疗许多疾病的新靶点[11-14]。Marfella等的研究表明，通过免疫组织化学方法和酶联免疫分析的方法，应用罗格列酮抑制泛素-蛋白酶体途径，可以通过减少IκB（转录核因子κB抑制子）的降解，从而抑制与NF-κB相关的炎症过程[15]。目前，针对泛素蛋白酶体系统的生物学靶点已经在蛋白酶体抑制剂与E1（泛素活化酶）、E2（泛素结合酶）、E3（泛素连接酶）方面得到扩展。在大多数肿瘤细胞中，泛素分子都呈高表达状态[16]。Choongseob等通过降低泛素UBB基因的表达量而成功抑制了体内、外肿瘤细胞的生长，其机制是通过促进细胞凋亡及调节NF-κB分子通路实现的[17-18]。因此可见，泛素化是调节NF-κB活化的一种重要机制。

在本试验中，通过构建shRNA质粒对泛素基因进行沉默，下调或终止其表达，可以达到抑制泛素蛋白合成的目的，研究转染该质粒后对猪小肠上皮细胞中TLR4/NF-κB信号通路的作用。结果显示，细胞内TLR4的mRNA表达量比空白对照组和空白质粒转染组低，随着转染时间增加，表达量逐渐降低，并在24 h时降至最低值;NF-κB的mRNA表达量也明显低于空白细胞组和空白质粒转染组，在12 h时降至最低值后逐渐升高，但仍低于空白细胞组中的NF-κB含量;IκB-α、MyD88的mRNA表达量也都低于同组的空白细胞组和空白质粒转染组，并且随着转染时间的增加，mRNA的表达量逐渐降低，均在24 h时出现最小值。试验结果表明，泛素基因沉默以及泛素的表达量下调，对TLR4/NF-κB信号通路起到了抑制作用，各下游分子的表达量均出现降低，其抑制作用很可能是通过抑制泛素化降解IκB而实现的。

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