高效液相色谱法检测慢性肾功能不全患者羟苯磺酸钙稳态血药浓度与eGFR及肌酐干扰值相关性分析*

余久如，卢锦莲，廖建红，蔡维望

(1.黄石市第二医院 a.检验科；b.肾病内科，湖北黄石 435002；2.黄石医养医学检验实验室，湖北黄石 435004)

羟苯磺酸钙作为改善微循环、抗血栓的药物临床使用较为常见，使用者中也包括一些肾功能不全的患者。这部分患者使用羟苯磺酸钙后肌氨酸氧化酶法血清肌酐大幅降低，导致患者认为该药物有明显的改善肾功能作用[1-2]。羟苯磺酸钙对肌氨酸氧化酶法血清肌酐检测的干扰已被体外干扰试验所证实[3]，且从干扰试验观察发现，肾功能不全患者血清中可能存在较高浓度的羟苯磺酸钙。健康人单次口服羟苯磺酸钙药代动力学报道[4-6]较多，未见稳态血药浓度报道。

本研究借鉴血清羟苯磺酸钙高效液相色谱法(HPLC)测定的文献[5-6]，采用HPLC法检测患者服用羟苯磺酸钙后稳态血清药物浓度，观察肾功能不全患者同非肾功能不全患者间的药物浓度的差异，分析药物浓度与肾小球滤过率(eGFR)及肌氨酸氧化酶法肌酐干扰值相关性。

1材料与方法

1.1 研究对象 选择于2016年5～10月间黄石市第二医院收治服用羟苯磺酸钙剂量为1.5 g/d(Tid)的患者30例。其中，肾功能不全组：20例慢性肾脏病患者(符合K/DOQI指南诊断标准)，男性13例，女性7例，年龄56.6(37～68)岁，入选标准：有肾功能不全(血清酶法肌酐高于120 μmol/L)。非肾功能不全组：本院收治非肾功能不全患者10例，男性7例，女性3例，年龄54.3(32～71)岁，入选标准：无肾功能不全(血清酶法肌酐低于90 μmol/L)。两组排除标准均为：有明显心、肺及肝功能障碍者，发热及血液白细胞计数高于参考范围者，未按规定剂量服药者。两组均采集患者羟苯磺酸钙服药5天后清晨空腹静脉血，分离血清-40℃保存待测。本研究征得患者知情同意，药物的使用仅依据病情的需要。

1.2 试剂和仪器 仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪，八方世纪BF-2000氮气吹干仪，上海精科雷磁PXSI-226离子计，sigma3K15离心机，海门市其林贝尔仪器制造有限公司QL-901涡旋振荡器；美国ABBOTT公司ARCHITECT C8000全自动生化分析仪，日本富士胶片株式会社FUJIFILM DRI-CHEM4000ie干式生化分析仪。

药品与试剂：口服羟苯磺酸钙为西安利君制药公司产品(0.5g/粒)；羟苯磺酸钙对照品(含量94.8%，批号：100573-201503)购自中国食品药品检定研究院；对氨基苯甲酸对照品(含量99.8%，批号：100017-201210)购自中国食品药品检定研究院；磷酸(分析纯)购自武汉市中天化工有限责任公司；磷酸二氢钾(分析纯)、四丁基氢氧化铵水溶液(10%，分析纯)均购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈(高效液相色谱纯)购自山东禹王实业有限公司化工分公司；水为二次去离子水；肌氨酸氧化酶法肌酐试剂购自浙江东瓯诊断产品有限公司；半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C)试剂购自宁波瑞源生物科技有限公司；脱亚胺酶法肌酐试剂购自日本富士胶片株式会社；质控品购自英国RANDOX公司；空白血清为未服药物且排除心、肝、肾等常见疾病的健康体检者混合血清。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件：色谱柱：Inertsil ODS-SP柱(5 μm，4.6*250mm，日本GL Sciences公司)，保护柱ODS-SP柱(5 μm，4.0*10mm，日本GL Sciences公司)；流动相：0.05 mol/L pH 3.0磷酸二氢钾缓冲液-乙腈(85∶15，v/v)，流动相中含0.1 mg/dl四丁基氢氧化铵[7]；流速：1.0 ml/min；检测波长：300 nm；柱温：35℃。

1.3.2 标准溶液及内标液配制：称取羟苯磺酸钙对照品200 mg(相当于羟苯磺酸钙189.6 mg)，用100 ml容量瓶加去离子水至刻度溶解成标准储存液。用去离子水稀释标准储存液配成浓度为19.0，37.9，94.8，189.6，474.0，948.0和1 896.0 mg/L的标准系列储存液；内标为对氨基苯甲酸，用去离子水配成50 mg/L浓度的内标储存液。上述储存液4℃避光冷藏备用。

1.3.3 标准系列(检测样品)处理：吸取0.25 ml空白血清(患者血清)于2.5 ml具塞尖底塑料离心管中，加入标准系列储存液 (去离子水)25 μl，加入内标储存液(50 mg/L)25 μl，混匀后加入1 ml乙腈沉淀蛋白，旋涡振荡1 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液0.65 ml于试管中，氮气吹干后加250 μl流动相溶解，混匀后取20 μl进样分析。

1.3.4 萃取回收率：取94.8，474.0，1 896.0 mg/L标准系列储存液，按“标准系列(检测样品)处理”法处理进样分析，每种浓度平行做6份，得到萃取后峰面积。另取上述标准系列储存液，除用去离子水替换空白血清外，其它按“标准系列(检测样品)处理”法处理，每种浓度平行做2份，取峰面积均值作为对照计算羟苯磺酸钙及内标萃取回收率。

1.3.6 准确度及精密度：取空白血清标本，以9∶1比例分别加入189.6，948.0，1896.0 mg/L标准储存液(对照加去离子水)配制3份浓度为18.96，94.80，189.60 mg/L的加标测试样品和1份对照样品，每份样品按“标准系列(检测样品)处理”法分别处理并进样检测，每天每种样品检测2次，连续5天，计算加标回收率、日内及日间精密度。

1.3.7 患者血清检测：按“标准系列(检测样品)处理”法检测稳态血药浓度，并同期检测其Cystatin C，肌氨酸氧化酶法肌酐和脱亚胺酶法肌酐。

2结果

2.1 方法专属性 在1.3.1色谱条件下，空白血清、空白血清加内标、空白血清加内标和标准液及1名患者血清色谱图见图1。羟苯磺酸钙、对氨基苯磺酸内标保留时间分别为：6.9和8.0min。色谱图表明，血清内源性物质不干扰羟苯磺酸钙测定。

A.空白血清；B.空白血清加内标；C.空白血清加内标和对照品；D.患者血清加内标。1.内标对氨基苯甲酸；2.羟苯磺酸钙。

图1血清羟苯磺酸钙及内标对氨基苯甲酸HPLC色谱图

2.2 萃取回收率 9.48，47.40，189.60 mg/L的羟苯磺酸钙萃取回收率分别为：75.6%±1.22%，75.7%±1.48%，75.1%±1.29%；内标对氨基苯甲酸萃取回收率分别为：94.4%±1.14%，94.6%±1.32%，94.5%±1.38%；羟苯磺酸钙及内标对氨基苯磺酸平均萃取回收率分别为：75.5%和94.5%。

2.3 线性范围及检测低限 标准系列浓度为1.90，3.79，9.48，18.96，47.40，94.80和189.60 mg/L，以羟苯磺酸钙与内标氨基苯磺酸峰面积比为横坐标(X)，以羟苯磺酸钙浓度为纵坐标(Y)，线性回归方程为：Y=33.733X-0.108 6(r2=0.999 1，P<0.01)。线性范围：1.90～189.60 mg/L，检测低限：0.452 mg/L。

2.4 准确度及精密度 平均加标回收率为98.9%(95.6%～103.6%)；18.96，94.80和189.60 mg/L三种浓度测试样品日内CV分别为4.8%，4.5%和4.1%，日间CV分别为6.3%，6.1%和5.4%。

2.5 肾功能不全组、非肾功能不全组稳态血清羟苯磺酸钙、eGFR检测结果 见表1。肾功能不全组和非肾功能不全组稳态血清羟苯磺酸钙浓度、eGFR检测结果比较，差异均有统计学意义(均P<0．001)。

表1 两组患者稳态血清羟苯磺酸钙浓度及eGFR比较

2.6 肾功能不全组稳态血清羟苯磺酸钙浓度与eGFR及肌酐干扰值相关性及回归分析结果 肾功能不全组稳态血清羟苯磺酸钙浓度与eGFR相关性显著(r=-0.790，P=0.000)，回归分析曲线见图2，回归方程为Y=608 0.61X-1.692(r2=0.975 3)，回归方程显著性检验F=710.882，P=0.001；肾功能不全组稳态血清羟苯磺酸钙浓度与肌酐干扰值相关性显著(r=0.816，P=0.000)，回归分析曲线见图3，回归方程为Y=0.002 7X2+0.343 5X+22.935(r2=0.987 5)，回归方程显著性检验F=671.064，P=0.000。

图2 肾功能不全组稳态血清羟苯磺酸钙浓度与eGFR回归曲线

图3 肾功能不全组稳态血清羟苯磺酸钙浓度与肌酐干扰值回归曲线

3讨论羟苯磺酸钙化学名2，5二羟苯磺酸钙，常用药物及对照品(标准品)为一水合物，分子式为(C6H5O5S)2·Ca2+·H2O。其溶于水以离子形式存在。本文为便于比较，HPLC检测中以无水羟苯磺酸钙记其浓度。HPLC检测羟苯磺酸钙报道方法较多，鉴于其较强的极性，保留时间短，故多选用极性较强的色谱柱延长保留时间。研究中也测试过不同pH及配比的流动相，选取了分离度较好的流动相配制方法。方法学评价显示方法专属性、准确度、精密度、线性范围均满足检测血清羟苯磺酸钙浓度的需要。

由于服药患者肌酐检测受到干扰，且基于Cystatin C计算的eGFR较简化MDRD评估方程[8-9]应用也较多，本文选用基于Cystatin C的eGFR评估患者的肾小球滤过功能。

文献报道[4-6]健康人单次口服500mg羟苯磺酸钙峰浓度(Cmax)9～18.0 mg/L，国秀芝等[10]报道HPLC法健康志愿者服药(1.5 g/d，Tid)3天后的血药峰浓度7.04～23.15 mg/L，与该研究非肾功能不全组基本吻合。同样用药剂量肾功能不全组稳态药物浓度数倍于非肾功能不全组，且肌氨酸氧化酶法肌酐测定的干扰值与药物浓度呈显著相关，也印证了药物体外干扰剂量效应实验[3]。羟苯磺酸钙主要以原形通过肾脏、肠道排泄，肾功能不全组稳态血清羟苯磺酸钙浓度与eGFR呈显著负相关，特别是当eGFR低于12 ml(min·1.73m2)-1时，稳态血清羟苯磺酸钙浓度急剧升高，显示eGFR对羟苯磺酸钙排泄的重要影响。

鉴于肾功能不全患者常规剂量服用羟苯磺酸钙后出现与eGFR呈负相关的药物蓄积，建议肾功能不全患者使用羟苯磺酸钙应依据eGFR降低用药剂量。