临床患者检测卡马西平药物基因位点在预防Steven-Johnson综合征和中毒性表皮坏死松解症中的应用*

程晓东，张 莹，胡玉皎，王 昊，周铁成，郝晓柯

(空军军医大学第一附属医院全军临床检验中心，西安 710032)

卡马西平(carbamazepine，CBZ)是精神运动性癫痫的首选药物，也可用于抗惊厥、抗神经性疼痛、抗躁狂-抑郁症等疾病的治疗。但是通过对中国汉族患者的回顾性研究发现，Steven-Johnson综合征(steven johnson syndrome，SJS)和中毒性表皮坏死松解症(toxic epidermal necrolysis，TEN)风险的发生与使用卡马西平以及患者体内携带人白细胞抗原(HLA)-B*1502等位基因的突变存在着很强的相关性，HLA-B*1502是卡马西平诱导SJteven-Tohnson综合征/中毒性表皮坏死松解症已知的生物学标志物[1-2]，因此首次使用卡马西平的患者在治疗前应进行HLA-B*1502等位基因的筛查。

本文使用数字化荧光检测仪和荧光染色原位杂交，实现小片段测序和SNP分型，对卡马西平耐药位点HLA-B*1502TA(C>G)和HLA-B*1502TB(C>T)进行检测，根据不同患者的基因型特性进行合理用药，达到提高药效、避免或减少毒副作用和不良反应发生的风险，为使用卡马西平药物的患者提供精准的用药指导。

1材料与方法

1.1 研究对象 我院2016年8月～2018年12月接受卡马西平耐药位点HLA-B*1502TA(C >G)和HLA-B*1502TB(C>T)检测的患者148例，其中男性62例，女性86例，平均年龄57.05±15.30岁。

1.2 试剂和仪器 试剂：10×NH4Cl预处理液，处理血液样本时用于裂解红细胞；耀金保(核酸纯化试剂)，用于在进行SNP分析前对标本进行保存；耀金分(测序反应通用试剂盒)，数字荧光分子杂交实验和化学药物用药指导项目的样本分析试剂；软件设定液，用于制备标准曲线；阳性对照监测仪器状态是否在控。所有试剂购于北京华夏时代基因科技发展有限公司。

仪器：荧光检测仪(西安天隆科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 试验样本：静脉全血，使用EDTA抗凝紫帽管采集，4℃低温保存，保存时间不宜超过24 h。

1.3.2 标本前处理：在1.5 ml离心管中加入1.0 ml 1×NH4Cl预处理液，吸取200 μl混匀的全血，室温静置5～10 min，红细胞完全破裂，离心管中液体变为澄清的红色后离心5 min。

吸取上层透明的红色液体后，向管底富集的白细胞团块中加入30 μl耀金保使白细胞的胞膜破裂。充分混匀，为了更好地使细胞核内的核酸游离出来，室温静置30～60 min，等待检测。

1.3.3 检测过程：样本检测：吸取1.5 μl处理后的白细胞样本加到相应的试剂中上机检测。阳性对照：吸取1.5 μl的阳性质控品分别加到对应的软件设定液中。阴性对照：吸取1.5 μl耀金保保存液，加到试剂中。

1.3.4 质控结果分析：阴性对照用以监测实验室和前处理过程中是否存在污染，检出结果应为“重测”；阳性对照用以监测实验能否正常检出阳性标本，检出结果应为阳性质控品的基因型。

1.4 统计学分析 收集记录相关数据，录入SPSS统计学软件，对数据进行分析处理。定性资料以百分率(%)表示，P<0.05为对比组之间的差异有统计学意义，P>0.05为对比组之间差异无统计学意义。

2结果

2.1 卡马西平化学药物基因位点检测结果 HLA-B*1502TA(C>G)位点检测结果为CC的患者126例，占总人数的85.14%；检测结果为CG的患者21例，占总人数的14.19%；检测结果为GG的患者1例，占总人数的0.67%。HLA-B*1502TB(C>T)位点检测结果为CC的患者109例，占总人数的73.65%；检测结果为CT的患者37例，占总人数的25.00%；检测结果为TT的患者2例，占总人数的1.35%，HLA-B*1502TA(C>G)位点与HLA-B*1502TB(C>T)位点检测结果比较，差异无统计学意义(χ2=6.855，P=0.192)。

2.2 卡马西平化学药物各个基因位点检测结果对临床的指导 见表1。对于HLA-B*1502基因，HLA-B*1502TA(C>G)和HLA-B*1502TB(C>T)基因均为野生型时，卡马西平类药物可以使用；HLA-B*1502TA(C >G)和HLA-B*1502TB(C > T)基因有杂合突变型基因58例(38.19%)，卡马西平类药物慎用；任何一个耐药位点突变成纯合突变，无论另一个耐药基因是野生型、杂合突变、纯合突变，卡马西平类药物均为禁用。

表1 卡马西平化学药物各个基因位点检测结果对临床的指导

3讨论卡马西平主要被肝脏的酶催化代谢成各种代谢产物，其中芳羟氧化物需被肝脏产生的环氧化物水解酶水解后才能由肾脏排出。若药物代谢过程中的关键酶结构发生变化，酶功能缺陷，药物在体内产生的代谢产物就不能被正常排出体外，这些代谢产物会对角质形成细胞产生细胞毒性作用，细胞毒性作用主要发生在Steven-Johnson综合征和中毒性表皮坏死松解症的早期。Steven-Johnson综合征和中毒性表皮坏死松解症是同一种疾病的不同阶段，根据疾病所累及的皮肤和黏膜的面积进行分类，剥脱皮肤的体表面积小于10%的患者称Steven-Johnson综合征；剥脱皮肤的体表面积大于30%的患者称中毒性表皮坏死松解症；剥脱皮肤的体表面积介于10%～30%之间的患者称重叠的Steven-Johnson综合征和中毒性表皮坏死松解症。Steven-Johnson综合征和中毒性表皮坏死松解症的风险与使用卡马西平以及患者体内携带(HLA)-B*1502等位基因的突变存在很强的相关性，且具有种族差异性。HLA基因是人类目前已知的最复杂的基因，位于人类染色体6p21.3。HLA基因是由一组紧密连锁的复等位基因位点组成，具有高度多态性，主要功能是将药物及其代谢产物包装，呈递给T细胞，使T胞活化，细胞毒性T细胞使自身淋巴细胞或皮肤角质形成细胞发生死亡。目前已发现了多个与Steven-Johnson综合征和中毒性表皮坏死松解症密切相关的HLA基因，HLA-B*1502等位基因的相关性最强[6]。

通过回顾性研究发现，不仅中国汉族患者使用卡马西平治疗后Steven-Johnson综合征和中毒性表皮坏死松解症风险的发生与体内携带(HLA)-B*1502等位基因的突变存在着很强的相关性[3]，马来西亚、泰国、新加坡等国家[4-5，7]的学者对这些国家的患者进行研究，也发现HLA-B*1502等位基因的突变不仅增加了Steven-Johnson综合征和中毒性表皮坏死松解症的风险，还会发生严重皮肤药物反应以及药物诱导的过敏皮疹伴嗜酸性粒细胞增多和全身症状，HLA-B*1502也被称作是公认的疤痕风险因素。

有学者研究了27例使用卡马西平治疗的亚洲癫痫患者，其中6例患者患有卡马西平诱发的Steven-Johnson综合征，11例患者患有卡马西平诱发的皮疹。对HLA-B*1502基因检测结果进行分析，6例Steven-Johnson综合征患者HLA-B*1502基因检测结果阳性；另外11例患有卡马西平诱发皮疹的患者中，有4例患者HLA-B*1502基因检测结果阳性。进一步证明对于亚洲人群，Steven-Johnson综合征和中毒性表皮坏死松解症的风险与使用卡马西平以及患者体内携带(HLA)-B*1502等位基因的突变存在很强的相关性[7]。通过研究汉族和白种人HLA-B*1502阳性的患者淋巴细胞毒性试验，中国人淋巴细胞毒性试验检测均为阴性，而白种人患者均为阳性。这些结果强烈提示不同种族背景患者卡马西平诱导的不同超敏反应的机制途径不止一个，而汉族人与HLA-B*1502等位基因的阳性结果强相关[8]。所以对于我国患者，首次使用卡马西平治疗前应进行HLA-B*1502等位基因的筛查。

本实验室对准备使用卡马西平治疗的148例患者进行HLA-B*1502TA(C >G)基因位点检测。HLA-B*1502TA(C >G)基因纯合突变的患者3例，这类患者禁止使用卡马西平以及卡马西平类药物，这类患者发生Steven-Johnson综合征和中毒性表皮坏死松解症的风险极高。HLA-B*1502TA(C >G)基因杂合突变的患者58例，这类患者慎用卡马西平以及卡马西平类药物，患者具有发生Steven-Johnson综合征和中毒性表皮坏死松解症以及卡马西平诱发皮疹的风险，在疗效大于风险的条件下密切观察用药后的不良反应。患者在用药前进行HLA-B*1502等位基因的筛查可以避免38.19%的患者发生卡马西平相关Steven-Johnson综合征、中毒性表皮坏死松解症和卡马西平诱发皮疹的发生，为患者提供安全的用药指导。