金银花复方制剂对人工感染NDV 雏鸡免疫器官T 淋巴细胞及其亚群以及B 淋巴细胞的影响

王洪梅，宋洋洋，于浩然，李天琦，刘 微，葛 铭

(1.东北农业大学动物医学学院,黑龙江 哈尔滨150030；2.黑龙江省教育厅动物普通疾病防治重点实验室,黑龙江 哈尔滨150030)

鸡新城疫(ND)是由副黏病毒科腮腺炎病毒属的新城疫病毒引起禽类的一种以呼吸道、消化道黏膜出血为典型病变的高度接触性、急性、败血性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列为A 类传染病。随着抗病毒中药的开发,发现许多中药具有预防和治疗ND 的作用。本试验通过金银花复方制剂对人工感染NDV 雏鸡免疫器官T 淋巴细胞及其亚群以及B 淋巴细胞的影响试验,研究结果表明,金银花复方制剂能够有效地抵抗NDV 感染,为临床上研发防治新城疫中药制剂的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物 金银花、连翘、鱼腥草、黄芪、白术、甘草,购自黑龙江省哈尔滨中药大市场。

1.2 病毒 鸡新城疫病毒(Mukteswar I 系),由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠,EID50为10-4.5。

1.3 试验动物 1 日龄海蓝白蛋雏鸡105 只,雌雄各半,购自某孵化厂。

1.4 金银花复方制剂的制备 准确称取金银花、连翘、鱼腥草、黄芪、白术、甘草各150 g,先将药物放入不锈钢锅内用清水浸泡1 h,加水量要淹没过药物3 cm,之后用武火先将浸泡好的连翘、鱼腥草、黄芪、白术、甘草煎煮,15 min 后加入金银花直至煮沸,再改用文火维持药物沸腾,继续煎煮40 min,用纱布将药汁过滤收集,再加适量清水继续煎煮,水量淹没过药物即可,煎煮火候同前,沸腾后再煎煮30 min,用纱布过滤药汁,将两次收集的药汁混合浓缩至150 mL,将浓缩液12 000 r/min 离心20 min,取上清液,用生理盐水定容至50 mL。

1.5 主要试剂 鸡淋巴细胞分层液(密度为1.077±0.001 g/mL)、优级胎牛血清(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)；细胞培养液RPMIl640(GIBCO公司)；L-谷氨酰胺(Amresco 公司)；Hepes、台盼兰(Sigma 公司)；2-巯基乙醇(浙江黄岩东门化工厂)；鼠抗鸡CD3-FITC 单抗、鼠抗鸡CD4-PE 单抗、鼠抗鸡CD8-CY5 单抗、鼠抗鸡Bu-1a-PE 单抗(SouthernBiotech 公司)；PBS(pH 值7.2 ～7.4)缓冲液(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.6 试验动物分组及处理 105 只海蓝白1 日龄雏鸡饲养至21 日龄,随机抽取15 只,翅静脉采血,用琼脂扩散法检测NDV 母源抗体为阴性,随机分成3 组,每组35 只,即对照组C 组、NDV 感染组I 组和NDV 感染金银花复方制剂治疗组T 组。I 组和T 组雏鸡经眼、鼻、口人工感染NDV,0.2 mL/只,C 组雏鸡经相同途径给予相同剂量的PBS。T 组雏鸡于感染后6 h 饮服金银花复方制剂治疗,剂量为1mL/只,每天给药1 次,给药方式为自由饮水,饮水前3 ～4 h 停水,连续7 d；I 组雏鸡为不治疗对照组,在人工感染NDV 后不应用任何药物治疗。以上各组雏鸡分别严格隔离饲养。

1.7 试验材料采取及处理 各组分别于感染后第1、3、5、7、14、21、28 天取材。每组每次随机抽取5 只雏鸡,称重,心脏采血处死,分别做如下处理:

无菌快速采取免疫器官(胸腺、脾脏、腔上囊),部分制成单细胞悬液,用于组织细胞培养、T 淋巴细胞及其亚群和B 淋巴细胞数量检测。

1.8 免疫器官(胸腺、脾脏)T 淋巴细胞及其亚型数量测定 无菌快速采取胸腺、脾脏,用尼龙网(200目)研磨挤压制成单细胞悬液,细胞悬浮于RPMI1640 完全培养液(以下统称为RPMI1640 培养液,内含200 IU/mL 青霉素、200 μg/mL 链霉毒、10%灭活胎牛血清、20 mmol/L Hepes、2 mmol/L L-谷氨酰胺、5×10-5mol/L 2-巯基乙醇)。淋巴细胞分离液密度梯度离心法(400 r/min 离心20 min)分离胸腺、脾淋巴细胞,再用RPMI1640 培养液离心洗涤(350 r/min 离心,15 min)3 次,用台盼兰拒染法检测细胞活力＞95%,同时进行细胞计数,调细胞浓度为1×107/mL,吸取制备好的胸腺及脾脏淋巴细胞悬液100 μL 分别到1.5 mL 的Eppendorf 管中,再分别向两管中同时加入10 μL CD3+单抗、CD4+单抗和CD8+单抗,充分混匀,避光4 ℃孵育30 min,每管加PBS 1 mL,4 ℃下1 500 r/min 离心5 min,弃上清液后再加入PBS 后上流式细胞仪测定CD3+、CD4+、CD8+量,并计算CD4+/CD8+值。

1.9 免疫器官(脾脏、腔上囊)B 淋巴细胞数量测定 无菌快速采取脾脏、腔上囊,制备脾脏、腔上囊淋巴细胞悬液,调细胞浓度为1×107/mL,吸取制备好的脾脏及腔上囊淋巴细胞悬液100 μL 分别到1.5 mL的Eppendorf 管中,再分别向两管中同时加入10 μL Bu-1a 单抗,充分混匀,避光4 ℃孵育30 min,每管加PBS 1mL,4 ℃下1 500 r/min 离心5 min,弃上清液后再加入PBS 后上流式细胞仪测定Bu-1a 量。

1.10 数据处理 结果以平均值±标准误(x±sx)表示,统计分析用SPSS 软件进行方差分析和多重比较。

2 结果

2.1 金银花复方制剂对人工感染NDV 雏鸡胸腺及脾脏CD3+标记的T 淋巴细胞的影响 从表1 可见,NDV 感染组雏鸡感染NDV 后3 ～28 d,胸腺CD3+标记的T 淋巴细胞数较对照组雏鸡不同程度减少,感染后3 ～14 d 明显降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)；NDV 感染组与金银花复方制剂治疗组胸腺CD3+标记的T 淋巴细胞数相比较于感染后5 ～7 d明显降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)。NDV 感染组雏鸡感染NDV 后3 ～14 d,脾脏CD3+标记的T 淋巴细胞数均不同程度的低于对照组雏鸡,感染后3 ～7 d 明显降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)；NDV 感染组雏鸡感染NDV 后5 ～7 d 脾脏CD3+标记的T 淋巴细胞数明显低于金银花复方制剂治疗组雏鸡(P ＜0.05 或P ＜0.01)。

表1 金银花复方制剂对人工感染NDV 雏鸡胸腺及脾脏CD3+标记的T 淋巴细胞的影响/%

2.2 金银花复方制剂对人工感染NDV 雏鸡胸腺及脾脏CD4+T 淋巴细胞亚群的影响 从表2 可见,NDV 感染组雏鸡感染NDV 后3 ～28 d,胸腺CD4+T 淋巴细胞亚群数均不同程度的低于对照组雏鸡与金银花复方制剂治疗组雏鸡,其中感染后3 ～14 d 与对照组雏鸡相比胸腺CD4+T 淋巴细胞亚群数明显降低(P ＜0.05 或P ＜0.01),感染后5 ～14 d 胸腺CD4+T 淋巴细胞亚群数明显低于金银花复方制剂治疗组(P ＜0.05 或P ＜0.01)。NDV 感染组雏鸡感染NDV 后3 ～14 d,脾脏CD4+T 淋巴细胞亚群数与对照组雏鸡相比不同程度的降低,感染后5 ～7 d 明显降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)；NDV 感染组雏鸡与金银花复方制剂治疗组雏鸡相比较于感染后5 ～7 d 显著下降(P ＜0.05)。

表2 金银花复方制剂对人工感染NDV 雏鸡胸腺及脾脏CD4+T 淋巴细胞亚群的影响/%

2.3 金银花复方制剂对人工感染NDV 雏鸡胸腺及脾脏CD8+T 淋巴细胞亚群的影响 从表3 可见,NDV 感染组雏鸡感染NDV 后3 ～28 d,胸腺CD8+T淋巴细胞亚群数不同程度的低于对照组雏鸡,其中于感染后3 ～7 d 显著低于对照组(P ＜0.05)；NDV感染组雏鸡感染NDV 后14 d,胸腺CD8+T 淋巴细胞亚群数明显低于金银花复方制剂治疗组(P ＜0.05)。NDV 感染组雏鸡感染NDV 后3 ～14 d,脾脏CD8+T淋巴细胞亚群数均不同程度的低于对照组雏鸡,感染后3 ～7 d 明显降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)；NDV 感染组雏鸡感染NDV 后7 d 脾脏CD8+T 淋巴细胞亚群数显著低于金银花复方制剂治疗组(P ＜0.01)。

2.4 金银花复方制剂对人工感染NDV 雏鸡胸腺及脾脏CD4+T/CD8+T 淋巴细胞亚群比值的影响 从表4 可见,NDV 感染组雏鸡胸腺CD4+T/CD8+T 淋巴细胞亚群的比值于感染NDV 后3 ～21 d 不同程度的低于对照组雏鸡,感染后5 ～7 d 显著降低(P ＜0.05),其余天数未见统计学差异(P ＞0.05)；金银花复方制剂治疗组雏鸡感染NDV 后14 ～21 d,胸腺CD4+T/CD8+T 淋巴细胞亚群的比值明显高于对照组雏鸡(P ＜0.05 或P ＜0.01)；NDV 感染组雏鸡与金银花复方制剂治疗组雏鸡相比较于感染后7 ～21 d胸腺CD4+T/CD8+T 淋巴细胞亚群的比值明显降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)。NDV 感染组雏鸡脾脏CD4+T/CD8+T 淋巴细胞亚群的比值于感染NDV后3 ～14 d 不同程度的低于对照组雏鸡,感染后7 d显著降低(P ＜0.05)；金银花复方制剂治疗组雏鸡感染NDV 后5 ～7 d 脾脏CD4+T/CD8+T 淋巴细胞亚群的比值明显高于对照组雏鸡(P ＜0.05 或P ＜0.01)；NDV 感染组雏鸡感染NDV 后5 ～14 d 脾脏CD4+T/CD8+T 淋巴细胞亚群的比值明显低于金银花复方制剂治疗组雏鸡(P ＜0.05 或P ＜0.01)。

表3 金银花复方制剂对人工感染NDV 雏鸡胸腺及脾脏CD8+T 淋巴细胞亚群的影响/%

2.5 金银花复方制剂对人工感染NDV 雏鸡脾脏及腔上囊B 淋巴细胞的影响 从表5 可见,NDV感染组雏鸡感染NDV 后3 ～28 d,脾脏B 淋巴细胞数不同程度的低于对照组雏鸡,感染后3 ～14 d明显低于对照组雏鸡(P ＜0.05 或P ＜0.01)；NDV 感染组雏鸡与金银花复方制剂治疗组雏鸡相比于感染后5 ～7 d 脾脏B 淋巴细胞数明显降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)。 NDV 感染组雏鸡感 染NDV 后3 ～28 d,法氏囊B 淋巴细胞数不同程度的低于对照组雏鸡,感染后3 ～7 d 明显降低(P ＜0.05 或P ＜0.01),其余天数未见统计学差异(P ＞0.05)；NDV 感染组雏鸡感染NDV 后5 ～7 d 腔上囊B 淋巴细胞数显著低于金银花复方制剂治疗组雏鸡(P ＜0.05)。

表4 金银花复方制剂对人工感染NDV 雏鸡胸腺及脾脏CD4+T/CD8+T 淋巴细胞亚群比值的影响/%

表5 金银花复方制剂对人工感染NDV 雏鸡脾脏及腔上囊B 淋巴细胞的影响/%

3 讨论

试验所用金银花复方制剂包括金银花、连翘、鱼腥草、黄芪、白术、甘草等。该方剂以金银花、连翘、鱼腥草为主药；黄芪、白术为辅药；甘草为佐药。研究发现,金银花和连翘具有显著的抗炎和抗病毒的作用；鱼腥草具有抗菌和增强免疫功能的作用；黄芪可以增强机体的免疫功能；白术能促进T 淋巴细胞增殖、分化,改变T 淋巴细胞亚群比例；甘草具有解毒、补中益气、调和诸药的作用[1-5]。

有报道称鱼腥草能够显著提高外周血T 淋巴细胞的比例,增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力,促进绵羊红细胞免疫所致的IgM 的生成,从而可以提高机体的特异性免疫能力[6]。郝钰等证实黄芪多糖可通过增强淋巴细胞与内皮细胞的粘附而促进淋巴细胞再循环,增加淋巴细胞与抗原的接触机会,从而扩大免疫反应,增强机体免疫功能[7]。还有报道指出,白术能够提高大鼠腹部手术后的脾细胞中的CD3+、CD4+、CD8+百分率,促进动物的免疫功能恢复[8]。潘曌曌等通过试验对几种常用的中草药进行体外抗内毒素效力比较,结果表明,以连翘、双花作用为最强[9]。本试验中金银花复方制剂治疗组雏鸡胸腺及脾脏CD3+标记的T 淋巴细胞数、CD4+T 淋巴细胞数及脾脏和腔上囊B 淋巴细胞数均于感染NDV 后3 d不同程度的回升,并且感染后3 ～28 d 不同程度的高于NDV 感染组雏鸡,感染后期接近对照组雏鸡水平,与已报道由金银花、连翘和黄芩组成的双黄连粉针剂能够提高免疫器官淋巴细胞及其亚群数的结果相一致[10]。表明金银花复方制剂可增加免疫T 淋巴细胞数量,可以提高免疫器官中CD4+T 淋巴细胞含量,能够促进腔上囊产生B 淋巴细胞,提高机体的免疫功能。

CD8+T 淋巴细胞属于抑制性T 淋巴细胞,在免疫细胞之间的调控中起重要作用[11]。本试验感染组雏鸡通过治疗后CD8+T 淋巴细胞数量升高,表明金银花复方制剂具有增强免疫器官CD8+T 淋巴细胞的作用,从而增强了机体的细胞免疫能力。

CD4+/CD8+比值是评价机体免疫状态的重要指标,其比值的高低,表明机体所处免疫状态的高低。雏鸡感染NDV 后,胸腺及脾脏CD4+/CD8+比值分别于感染后3 ～21 d、3 ～14 d 不同程度的低于对照组雏鸡,表明NDV 可降低机体的免疫能力,使机体处于较低的免疫状态下,金银花复方制剂治疗组雏鸡胸腺及脾脏在感染后3 ～28 d、5 ～21 d 不同程度的高于对照组和NDV 感染组雏鸡,表明金银花复方制剂能提高免疫器官CD4+/CD8+比值,增强机体抵抗NDV 的能力。