芹菜素衍生物芫花素对非洲猪瘟病毒感染的抑制作用

张爱琼 ，梁海英，曾智勇 （编译）

（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属一种双链DNA病毒。常引起猪的急性、热性、高度接触性传染病，发病率高，病死率可高达100%。最近，非洲猪瘟病毒在欧盟国家和中国暴发流行，严重威胁着畜牧产业的健康发展，给养殖业带来了巨大的经济损失。由于目前没有有效的疫苗和抗病毒药物对其进行控制，使其进一步暴发蔓延成为可能。基于非洲猪瘟疫情的暴发与流行，Hakobyan A 等对抗ASFV 的有效抗病毒药物进行了研究。

芹菜素是一种植物来源的黄酮类化合物，该化合物以其生物活性而闻名，包括对丙型肝炎病毒、肠道病毒-71 和口蹄疫病毒的抗病毒作用。然而，芹菜素在化学上是不稳定的并且几乎不溶于高极性溶剂，例如水，在植物中它通常以衍生形式存在。Hakobyan A 等在研究中为评估商业上可获得的芹菜素衍生物（葡糖基化或甲基化）对ASFV 的抗病毒活性，对金合欢素（Acacetin）、芹黄素葡糖苷（Apigetrin）、芫花素（Genkwanin）、野 漆 树 甙（Rhoifolin）、 牡 荆 素(Vitexin)、牡荆素-2-O-鼠李糖苷（Vitexin-2-O-rhamnoside） 六 种 化合物（结构式见图1A）进行了测试。其首先通过使用MTT[溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑]测定，在Vero 细胞（体外ASFV 感染的细胞）中筛选芹菜素衍生物的细胞毒性。结果显示这6 种化合物可根据其细胞毒性特征分为两组，野漆树甙和芹黄素葡糖苷表现出很高的细胞毒性，表明C7 位的碳水化合物部分可能增加芹菜素衍生物的体外毒性。相比其余四种化合物，其中芫花素（595.1±45.5μM）和牡荆素-2-O-鼠李糖苷（409.1±50.2μM）显示出比金合欢素（659.1±25.9μM）和牡荆素（783.5±64.5μM） 略 高 的 毒 性（图1B）。同时在MEM 中制备的工作溶液中没有观察到DMSO 浓度（＜1%）的细胞毒性。

为了测试芹菜素衍生物是否具有抗ASFV 的抗病毒活性，其用ASFV/Ba71V 感染在96 孔培养板中生长的Vero 细胞，用芹菜素衍生物（每个化合物6 个孔）处理，金合欢素和牡荆素的浓度为20 μM，芫花素和牡荆素-2-O-鼠李糖苷的浓度为40 μM，感染进行了96 h，直到处理的细胞中发生总细胞病变效应（CPE）。收集上清液并通过基于CPE 的测定滴定，滴度通过Spearman-Kärber 终点法计算并表示为TCID50/ml。结果显示，在所选择的四种化合物中，只有芫花素显著降低病毒滴度从6.5±0.1到4.75±0.25 log TCID/ml（图1C）。基于某些黄酮类化合物对DNA 和RNA 病毒具有直接地杀病毒活性，其首先进行了芫花素对细胞外ASFV 颗粒的影响研究，结果显示处理和未处理的Vero 细胞之间病毒滴度的差异在统计学上是不显著的，表明芫花素不能损害细胞外病毒颗粒。在细胞进入之前排除了芫花素的杀病毒活性。同时其对ASFV 病毒的附着和内化进行了测定，结果表明芫花素能够干扰ASFV 感染的附着和内化阶段，这与病毒进入宿主细胞密切相关并且是必需的，但确切机制还需进一步研究探索。由于ASFV向细胞表面的转运依赖于微管，秋水仙碱和诺考达唑等微管蛋白聚合抑制剂能够抑制细胞中ASFV 的释放，通过研究后推测芫花素可能通过破坏沿着微管的病毒运动来抑制ASFV 从宿主细胞中的排出。

为了进一步证实其抗病毒效果，测定了用芫花素处理后ASFV细胞中病毒DNA 的数量。即将生长在盖玻片上并用ASFV/Ba71V 菌株（2TCID50/细胞）感染的Vero 细胞暴露于浓度为10、20、40 μM 的芫花素中。在感染后16 h，将细胞在96%乙醇溶液中固定30 min，并通过Feulgen 的方法在新鲜的希夫氏试剂中染色。通过计算机配备的显微镜-细胞仪在575 nm 处测量病毒细胞的DNA 含量，并表示为集成光学密度（IOA）。结果显示，在处理的Vero 细胞中，ASFV 含量显着少于模拟处理细胞中的，表明40 μM 浓度的芫花素也可能阻碍病毒DNA 复制。当ASFV 感染的细胞暴露于芹菜素和染料木黄酮时获得了类似的结果。

图1 芹菜素衍生物的化学结构（A），细胞毒性（B）和抗ASFV 活性（C）

通过免疫印迹分析评估了在芫花素存在下早期（p32）和晚期（p72）病毒蛋白的表达，即在70 mm 培养皿中生长的Vero 细胞用ASFV/Ba71V 分离物感染，在吸附期后暴露于浓度为10、20、40 μM 的芫花素中。在蛋白质提取之前，将细胞在补充有蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物的冰冷改良RIPA缓冲液中裂解。使用聚丙烯酰胺分离凝胶对澄清的全细胞裂解物进行SDS-PAGE 凝胶电泳并通过电印迹转移至0.2 μm 孔径的硝酸纤维素膜上。用封闭液在室温下封闭1 h 后，与特异性一抗孵育1 h，然后将膜与带有HRP 的适当的二抗在室温下孵育1 h，最后用PBST 洗涤3 次，并用化学发光检测试剂盒检测蛋白质。结果显示，经40 μM 浓度的芫花素处理后，两种蛋白质的合成均显着降低，且较低浓度的芫花素的存在也对晚期但非早期蛋白质的合成有影响，表明该化合物可能主要通过未知机制干扰晚期ASFV 基因的表达。

在猪中，单核细胞和巨噬细胞是ASFV 感染的主要目标。因此，进行了实验来确定芫花素对猪巨噬细胞中毒性ASFV 分离株（亚美尼亚/07）的影响。用与Vero 细胞实验相同的芫花素浓度（40 μM）处理ASFV 感染的巨噬细胞，将巨噬细胞接种在96 孔板中，并通过血细胞吸附（HAD）测定进行滴定。测定显示，在感染的早期或晚期加入芫花素后，ASFV 的产率显著降低。两个阶段芫花素的影响表明，其可以阻止病毒进入和离开猪巨噬细胞。在病毒附着步骤中用芫花素处理猪巨噬细胞导致ASFV 产量从5.0±0.3 log HADU50/ml 降低至3.6±0.2 log HADU50/ml。当在ASFV感染的内化阶段加入芫花素时，也观察到显著的抗病毒效果。病毒出口测定显示，在猪巨噬细胞中第一轮ASFV 感染后释放的病毒后代减少了1.2 log。这些结果表明，芫花素不仅能够抑制ASFV Ba71V，还能够抑制现在在欧洲和中国流行的高毒性ASFV 分离株。

总之，现已将芫花素鉴定为有效的抗ASFV 化合物，其靶向病毒进入和离开感染阶段。芫花素可以抑制猪巨噬细胞中高毒性ASFV 分离株的复制，这强调了其作为抗病毒药物开发候选物的价值。这是关于芫花素体外抗病毒活性的第一份报告，表明未来的研究可能扩大其作为抗病毒剂对抗其他病毒的应用范围。